Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Während der embryonalen Entwicklung des Gehirns, werden Projektionsneuronen des zerebralen Kortex in der ventrikulären Zone erzeugt wird, ein mehrreihigen Epithel von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC) besteht, die Linien der lateralen Ventrikel. Unter NSPC die radialen Gliazellen (RGC), die als neuronale Stammzellen dienen, unterzogen interkinetic Kernwanderung (INM): sie Mitose führen an der Oberfläche der Herzkammer und der S-Phase an der Grundgrenze des ventrikulären Zone (VZ) ^{1, 2,3.} Sie können entweder symmetrisch teilen, um zwei RGC erzeugen oder asymmetrisch um ein RGC und ein Neuron oder eine Zwischenvorläuferzelle (IPC) ^{4, 5} zu erzeugen. IPC wandern zu einer darüberliegenden Schicht wuchernden genannt Subventrikularzone (SVZ), wo nach einem letzten symmetrische Teilung sie zwei unreifen Projektionsneuronen ^6-8 generieren. Im Gegensatz zu RGC, IPC nicht unterziehen INM ⁽⁹ Bewertung). Neu erzeugte Neuronen MIGRaß radial entlang der radialen Fasern durch die Zwischenzone (IZ) an ihren Bestimmungsort in der kortikalen Platte (CP) ^{10, 8} zu erreichen. Das perfekte Timing aller dieser Ereignisse ist von wesentlicher Bedeutung für eine korrekte kortikalen Entwicklung. Zum Beispiel der Wechsel von Proliferation, die Differenzierung von neuronalen Vorläuferpopulationen wird durch die Dauer der G1-Phase ^{11, 12} gesteuert. Die Verlängerung der G1-Phase korreliert somit mit der Zelldifferenzierung.

Genotoxische Stress, wie ionisierende Strahlung, stark beeinträchtigen die Entwicklung des Gehirns (in ¹³ überprüft). Wir und andere haben gezeigt, dass NSPC sind sehr anfällig für strahlungsinduzierte Apoptose ^{14, 15,16.} Ionisierende Strahlung induziert DNA-Doppelstrangbrüche, die am meisten zu schweren Schäden an wuchernden Zellen sind. Eine wesentliche Komponente der DNA-Schadensantwort (DDR) in Rad-Zellen die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in der G1 / S oder G2 / M-Übergänge oder während SPhase (intra-S-Checkpoint) ^17-21. Sie blockieren die Zellzyklus-Progression, um Zeit für DNA-Schäden zu reparieren oder Beseitigung von beschädigten Zellen zu liefern. Folglich kann Zelltod sowie verzögerte Progression des Zellzyklus die Entwicklung des Gehirns als Reaktion auf ionisierende Strahlung ^22-24 verändern. Es war daher interessant, ein Verfahren, um die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in NSPC im bestrahlten Maus embryonale Gehirn beurteilen zu entwickeln.

Das Fortschreiten des Zellzyklus wird routinemäßig mit dem Einbau eines Thymidin-Analogon, 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) gefolgt. BrdU während der S-Phase des Zellzyklus, wenn die DNA repliziert aufgenommen. Die Verwendung von einem Antikörper gegen BrdU ermöglicht danach die Detektion von Zellen, in die S-Phase während des Pulses von BrdU waren.

Eine neuartige Thymidin-Analogon, 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EDU) von einem fluoreszierenden Azid detektiert. Die verschiedenen Möglichkeiten, um EdU und B zu erkennen RDU nicht kreuzreagieren, ^25, die den gleichzeitigen Nachweis beider Thymidin-Analoga, die nützlich für das Studium der Zellzyklusprogression ist. Normalerweise Zellen werden zunächst mit EdU gepulst und dann mit BrdU, wo die Zeit zwischen den beiden Eingemeindungen dauert zwei Stunden ^{25, 26} gepulst. Zugabe von BrdU in Kulturmedien, die EdU führt vorzugsweise Einbau von BrdU in die DNA unter Ausschluss von Bildung, während gleichzeitiger Zugabe von ²⁵ EdU mit äquimolare oder äquimolare BrdU Hälfte der Medien ergibt nur BrdU-Inkorporation ^27. Dies erleichtert die doppelten Markierungsprotokoll durch die Beseitigung der Waschschritte, die normalerweise erforderlich sind, um die erste Markierung aus dem Kulturmedium vor der Zugabe des zweiten Etiketts zu entfernen. Dies ist auch von besonderem Interesse für die in-vivo-Studie, in der die Waschschritte sind nicht möglich, den genauen Zeitpunkt der S-Phase Eintritt oder Austritt von Zellpopulation zu bestimmen.

t "> Kürzlich wurde ein Verfahren zur Zwei-Puls-Markierung in embryonalen Mäusehirn EdU und mit BrdU ^{23, 24,22} ist entwickelt worden, um die Zellzyklusprogression und INM der NSPC nach Bestrahlung in utero zu analysieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass bei S-Phase, Maus-Zellen replizieren zunächst die Euchromatin Regionen und dann die perizentrischen Heterochromatin ^28,29,30. Interessanterweise perizentrischen Heterochromatin von verschiedenen Chromosomen in interphasic Kerne gruppiert, um heterochromatischen Herde auch als Chromozentren bekannt und leicht durch DAPI-Färbung als helle Herde nachweisbar bilden. Daher werden die Differenz EdU und BrdU-Färbungen von Euchromatin und Chromozentren half uns, genauer zu analysieren Fortschreiten der S-Phase NSPC.

Diese Methode erlaubt die Demonstration der scheinbaren Mangel an G1 / S Kontrollpunkt in NSCP ^22-24, die ganz überraschend ist, da diese Checkpoint soll entscheidend für die Genomstabilität sein. Mehrere experimental Designs basierend auf verschiedenen Kombinationen von Bildung und BrdU-Impulse werden verwendet, um die Zellzyklusprogression in der ventralen und dorsalen Telen analysieren. Hier geben wir ein Beispiel für die Protokolle, die die Untersuchung der akuten DNA-Schäden von NSPC innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Bestrahlung in utero E14.5 Mausembryonen.