Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen, zijn projectie neuronen van de cerebrale cortex opgewekt in de ventriculaire zone, een pseudo-epitheel uit verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC) lijnen die de laterale ventrikels. Onder NSPC de radiale gliacellen (RGC), die als neurale stamcellen ondergaan interkinetic nucleaire migratie (INM) die mitose treden op het oppervlak van het ventrikel en S-fase bij de basale grens van de ventriculaire zone (VZ) ^{1, 2,3.} Ze kunnen ofwel symmetrisch verdelen twee RGC genereren of asymmetrisch een RGC en een neuron of een tussenproduct progenitor cel (IPC) ^{4, 5} genereren. IPC migreren naar een bovenliggende uitdijende laag genaamd subventriculaire zone (SVZ), waarna een laatste symmetrische verdeling genereren ze twee onvolwassen projectie neuronen ^6-8. In tegenstelling tot RGC, hoeft IPC ondergaan INM (beoordeeld ^9). Nieuw gegenereerde neuronen migraten radiaal langs de radiale vezels via de tussenliggende zone (IZ) naar hun eindbestemming te bereiken in de corticale plaat (CP) ^{10, 8.} De perfecte timing van al deze gebeurtenissen is essentieel voor een goede ontwikkeling van de hersenschors. Bijvoorbeeld de overgang van proliferatie differentiatie van neurale populaties wordt geregeld door de G1 faseduur ^{11, 12.} De verlenging van de G1 fase correleert dus met celdifferentiatie.

Genotoxische stress, zoals ioniserende straling, ernstige aantasting hersenontwikkeling (besproken in ^13). Wij en anderen hebben aangetoond dat NSPC zijn zeer gevoelig voor straling geïnduceerde apoptose ^{14, 15,16.} Ioniserende straling veroorzaken DNA dubbelstrengs breuken die het meest ernstige schade aan delende cellen. Een essentieel onderdeel van DNA-schade Response (DDR) in delende cellen is de activering van de celcyclus checkpoints op de G1 / S of G2 / M overgangen of tijdens Sfase (intra-S checkpoint) ^17-21. Ze blokkeren de voortgang van de celcyclus te tijd te geven voor DNA-schadeherstel of eliminatie van te beschadigde cellen. Bijgevolg kan celdood en vertraagde celcyclusprogressie hersenontwikkeling veranderen in reactie op ioniserende straling ^22-24. Het was dus interessant om een ​​werkwijze voor de activering van celcyclus in NSPC in de bestraalde muis embryonale hersenen beoordelen.

De progressie van de celcyclus wordt routinematig gevolgd met de opname van een thymidine analoog, 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU opgenomen in de S-fase van de celcyclus, bij DNA replicatie. Het gebruik van een antilichaam tegen BrdU kan daarna de detectie van cellen die gedurende de puls van BrdU in S-fase waren.

Een nieuw thymidine analoog, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) wordt gedetecteerd door een fluorescerende azide. De verschillende manieren om te detecteren EDU en B RDU geen kruisreactie ^25, die gelijktijdige detectie van thymidine analogen, die nuttig is voor de studie van de celcyclus. Meestal cellen worden eerst gepulst met Edu en vervolgens gepulseerd met BrdU, waarbij het ​​tijdsverloop tussen beide oprichtingen duurt paar uur ^{25, 26.} Toevoeging van BrdU in kweekmedia die edu leidt voorkeur opname van BrdU in het DNA met uitzondering van EDE, terwijl gelijktijdige toevoeging van edu ²⁵ met equimolaire of halve equimolaire BrdU de media resultaten slechts BrdU incorporatie ^27. Dit vereenvoudigt de dubbele labeling protocol door eliminatie van de wasstappen die normaal nodig zijn om het eerste label van het kweekmedium voorafgaand aan de toevoeging van het tweede label te verwijderen. Dit is ook van bijzonder belang zijn voor in vivo onderzoek, waar de was-niet mogelijk zijn, om de precieze timing van de S-fase-of uitreis van de cel bevolking te bepalen.

t "> Onlangs, een werkwijze dual-pulse labeling embryonale muizenhersenen met edu en BrdU ^{23, 24,22} is ontwikkeld om celcyclusprogressie en INM van NSPC onderzoeken na de bestraling in utero. Bovendien is aangetoond dat bij S-fase, muis cellen repliceren eerst de euchromatin regio en vervolgens de pericentric heterochromatin ^28,29,30. Interessant pericentric heterochromatin van verschillende chromosomen geclusterd in interfase kernen te heterochromatic brandpunten ook wel bekend als chromocenters en gemakkelijk door DAPI kleuring zo helder brandpunten vormen. Daarom is de differentiële Edu en BrdU kleuringen van euchromatine en chromocenters ons geholpen om meer precies S-fase progressie van NSPC analyseren.

Deze methode kon de demonstratie van het schijnbare gebrek aan G1 / S checkpoint in NSCP ^22-24, dat is heel verrassend aangezien dit ijkpunt zou van cruciaal belang voor stabiliteit van het genoom te zijn. Verschillende experimental ontwerpen op basis van verschillende combinaties van onderwijs en BrdU pulsen gebruikt om celcyclusprogressie te analyseren in de ventrale en dorsale telencephalon. Hier geven we een voorbeeld van protocollen waardoor de studie van de acute DNA schade NSPC binnen de eerste 4 uur na bestraling in utero van E14.5 muizenembryo's.