Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması

Makrofajlar dahil olmak üzere, profesyonel fagositlerin, bağışıklık sisteminde önemli bir oyun. Doğuştan gelen bağışıklık sistemindeki ilk savunma hattı olmasının yanı sıra, aynı zamanda bir rol ^1-3 sunulması da sinyalizasyon ve antijen ile edinilmiş bağışıklık aktivasyonunda kritik bir rol oynamaktadır. Profesyonel fagositlerin işlevi çok yönlü iken, fagosom olgunlaşma profesyonel fagositlerin ^4,5 bakterisit ve antijen işleme fonksiyonlarının kritik bir omurgadır. Reseptör aracılı yutulma ve bakteriler gibi bir fagositik hedef, alımından sonra, olgunlaşmamış fagosom etkileşim ve endositik ağ bölümlerinde ve çeşitli diğer hücresel organel ⁶ değişim karmaşık ve iyi ayarlanmış bir dizisi boyunca geçer. Bileşiklerin yapısı, bu hücresel varlıklar olarak düzenlenmesi ile değiştirilir ve füzyon olayların zamanlama luminal phagosomal ortamı ve phagos belirleromal membran bileşimi ve böylece ^7, olgunlaşan fagozomun ⁸ kaderi.

Fagosom olgunlaşma fizyolojik alaka, kaçmak tutuklama veya fagosom olgunlaşmasını ⁹ yıkmak için çeşitli hücre içi patojenler tarafından istihdam çeşitli stratejiler ile örneklenmiştir. Hidrolitik enzim ve olgun fagozomun ⁷ arasında anti-bakteriyel faktörler bir kısmı ile endows geç endozomal / lızozomal bölmeli fagozomun füzyon: Bu stratejilerin çoğu doğrudan ya da dolaylı olarak fagosom olgunlaşma sürecinin son ve kritik aşamaya önlemek ^{, 8,10.} Doğal fizyolojik bir durum kullanılan ediliyor, özellikle deneysel ayarları altında etkilenen olumlu ya da olumsuz olması halinde, bu nihai ve kritik adım Analizi nedenle phagosomes olgunlaşma durumu hakkında güçlü göstergeler ile bize sağlayabilir ve.

Geç endozomal / lizozomal bölmesis genellikle çeşitli varlığı ile erken endositik bölmelerden tanımlanmış ve ayırt edici endositik yolunun terminal bölmeleri, spesifik, marker moleküllerin sahne olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, diğerleri ¹¹ arasında Lizozomal ilişkili membran proteinleri (lambalar) gibi hidrolitik enzimler veya membran bileşenleri için. Terminal endositik bölmeleri-bundan böyle lizozomlar-da fagositik / endositik yolunun ¹² sonunda sindirim son aşamaları için ana konum olarak hizmet basitçe olarak anılacaktır. Bu şekilde, sindirilemez sondalar hücre dışı ortamdan endositoz ve makropinositoz yoluyla yüklenebilir ve alımı ve Chase belirlenmiş bir döngü takip sonra ^13,14 birikir lizozomlara endositik yolu aracılığıyla taşınır. ^15-17 endocyticprobes gibi organik sindirilemez polimer dekstran gibi floresan mikroskobu için fluorofor-konjuge problar yaygın olarak kullanılmaktadır.

<p clasbu yöntemde, s = "jove_content"> biz phagosomes için lızozomal luminal içerik teslim analiz ederek fagosom olgunlaşmasını araştırmak fagositik kargo olarak IgG kaplı mikroboncuk kullanımını tarif eder. Canlı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile time-lapse video görüntülemede lizozomların bir kolaylıkla saptanabilir marker olarak flüorofor-konjuge dekstran prob kullanarak, yüksek olan phagosomes içine kargo teslim dinamik sürecini takip zamansal çözünürlük. Daha sonra istatistiksel olarak Microsoft Excel kullanarak analiz ve GraphPad yazılımı ^14,18 kullanarak sunulan, toplanan time-lapse görüntüleme verileri, açık kaynak kodlu ve serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı, Fiji (veya ImageJ) kullanılarak değerlendirilebilir anlatacağız.

Bizim yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler fagosom olgunlaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye ayarları ve faktörler kullanılarak dizayn edilebilir; hemen her otyapışık birincil veya hücre hattı fagositik hücrelerin kendi türü de dahil olmak üzere fonksiyon deneyler genetik kaybı gen nakavt ve knock-down, mutantlar veya füzyon proteinleri, fagositik-hedefler, microbead kaplama bileşikleri, endozomal / lizozomal sondaları ve faktörlerin böyle bir ifade diğerleri arasında sitokinler, kimyasal inhibitörleri veya siRNA bu yöntemin temel yaklaşım uygulanabilir tüm değişkenlerdir.

Biz aşağıdaki gibi bu yöntemin hedefi ve temel gereksinimlerini tanımlar:

• Yöntemin Hedef: fagositik canlı hücreler yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fagosom olgunlaşma, doğrudan nicel ve nitel gözlem ve analiz sağlamaktır.
• Fagositik yük: Bir uygun şekilde kaplanmış mikro parçacık veya biyolojik hedef. Burada kolayca Fc-γ reseptörü aracılığıyla fagositoz ile içselleştirilir 3 um küresel polistiren mikro-IgG kaplı kullanın. Seçenek olarak ise, bir mikroorganizma ya da kaplanmış mikrofon, retina reseptör hücrelerde mevcut olduğu için roparticle kullanılabilir.
• Fagositik hücreler: Uygun fagositik reseptörlerini sentezleyen Yapışık fagositik hücreler. Burada bol Fc-γ reseptörlerini ifade fare primer BMMs kullanın. Alternatif olarak, dendritik hücreler (DC), monositler veya fagositik epitel hücreleri ya da bunların mutantlan ya da genetik knock-out varyantlar kullanılabilir.
• Lizozomal kargo: Bir floresan etiketli lizozomal prob. Burada, Texas Red-konjüge edilmiş dekstran 70,000 kiloDalton (Dex70kD) lizozomlara luminal yük olarak kullanılır. Alternatif olarak, bu asitlik veya indirgeyici kapasitesi phagosomal özellikleri için bir hücre bölmesi veya organel ya da uygun bir prob, floresan bir saptanabilir marker ile etiketlenebilir fagosom olgunlaşma ilerlemesini incelemek için kullanılabilir.
• Örneğin, molekülleri, kimyasal bileşikler, gen knock-down, ya da olabilir mutant proteinlerin geçici ifadesini sinyalizasyon: etkileyen faktörler. Burada, biz Förg varbasitlik uğruna böyle bir faktör biri kullanılması, ancak mutant protein ifade ve Kasmapour vd. ^18. phagosomes fagositozunu veya şartlar ve hareketlilik etkileyebilir ve / olabilir Herhangi bir faktör bakın lütfen knock-down etkileyen faktörler ile yeni bir örnek ya da olgunlaşma phagosomes etkileşim bölmeleri potansiyel olarak kullanılabilir.