在现场研究巨噬细胞吞噬溶酶体生源

专业的吞噬细胞，包括巨噬细胞，发挥着关键的免疫系统。除了 ​​作为防御的第一线中的先天免疫系统，它们也激活适应性免疫通过其信令和抗原中发挥关键作用呈递作用^1-3。虽然专业吞噬细胞的功能是多方面的，吞噬体成熟是专业吞噬细胞^4,5的杀菌和抗原处理功能的关键支柱。经受体介导的吞噬和吞噬靶，如细 ​​菌的吸收，新生的吞噬体经过一个复杂的和精心策划的互动和交流与内吞网络的舱室和其他一些细胞器⁶的序列。所述化合物的性质交换与这些细胞的实体，以及调节和融合事件的定时决定了管腔吞噬体环境和phagosOMAL膜组成，因此^7，成熟的吞噬体⁸的命运。

吞噬体成熟的生理意义是由各种细胞内的病原体采用从逃跑，逮捕或颠覆吞噬体成熟⁹多样化战略例证。大多数这些策略的直接或间接阻止吞噬体成熟过程的最后和关键的阶段：融合吞噬体与晚期胞内体/溶酶体区室，因而具有大量的水解酶和一个成熟的吞噬体⁷的抗菌因素^，8,10。因此，这最后的和关键的一步分析，可以为我们提供强有力的指标有关的吞噬体的成熟的状态，如果自然的生理状态是正面或负面的根据正在使用的特定的实验设置的影响。

晚期内体/溶酶体S是通常被认为是内吞途径的终端室，通过各种存在的定义，并区别于早期的内吞车厢，特定阶段，标记分子。例如水解酶或膜成分，例如溶酶体相关膜蛋白（灯）等等^11。终端内吞区室，此后简称为溶酶体，也可作为消化的最后阶段的主要位置处的吞噬/内吞途径¹²的端部。以这种方式，不易消化的探针可以通过内吞作用和巨胞饮作用从细胞外环境被加载，并通过内吞途径到溶酶体，在那里它下面定义的摄取和追逐的循环后累积^13,14输送。荧光团共轭的探针，用于荧光显微镜，诸如有机聚合物的不易消化葡聚糖通常用作endocyticprobes ^15-17。

<p class ="“jove_content”">在该方法中，我们描述了IgG包被的微珠的利用率作为吞噬货物通过分析交付溶酶体腔内容到吞噬体，调查吞噬体成熟。通过使用荧光标记的葡聚糖探针在活的骨髓来源的巨噬细胞（BMM）和延时视频成像与激光共聚焦扫描显微镜溶酶体的易检测的标记，我们按照货物配送的动态过程分成吞噬体与高时间分辨率。然后，我们将介绍如何收集时间推移成像数据可以用开源及可自由查看的图像分析软件，斐济（或ImageJ的）进行评估，统计分析采用Microsoft Excel和使用GraphPad Prism软件^14,18呈现。

按照我们的方法的描述，类似的实验，可以使用修改后的设置和因素，探讨其在吞噬体成熟的影响进行设计;几乎任何OT她的类型附着的初级或细胞系吞噬细胞，功能实验包括遗传损失基因敲除和敲除体，突变体或融合蛋白，吞噬靶，微珠涂覆化合物，核内体/溶酶体探针和因素，例如一个表达细胞因子，化学抑制剂，或siRNA等等都可以应用这种方法的基本方法的所有变量。

我们定义该方法的如下目标与基本要求：

• 目标的方法：启用直接，定量和定性的观察吞噬体成熟和分析生活中的吞噬细胞高时间分辨率。
• 吞噬货物：一个适当包衣微粒或生物靶标。在这里，我们用IgG包被通过的Fc-γ受体介导的吞噬作用容易内化3微米的球形聚苯乙烯微粒。另外，任何微生物或涂层麦克风可用于roparticle为其中吞噬受体是存在于细胞中。
• 吞噬细胞：表达适当的吞噬受体粘附吞噬细胞。在这里，我们用鼠标主要桥梁养护管理的丰富表达的Fc-γ受体。可替换地，树突状细胞（DC），单核细胞或吞噬上皮细胞或其遗传突变或敲除变体也可以使用。
• 溶酶体货物：一个荧光标记的溶酶体探针。这里，德克萨斯红偶联70000千道尔顿的葡聚糖（Dex70kD）用作溶酶体的腔货物。可替换地，一个细胞区室或细胞器，或用于吞噬体性能如酸度或降解能力的适当的探针的任何荧光检测的标志物，可用于研究吞噬体成熟的进展。
• 影响因素：例如，信号分子，化合物，基因敲下来，或突变蛋白可能的瞬时表达。在这里，我们已经锻件1使用这样的一个因素为简单起见，但对于最近的一个例子与突变体蛋白的表达和敲低影响因素请参阅Kasmapour 等人 ^18，可以影响细胞吞噬吞噬体或情况和迁移率和/不限因子或与吞噬体成熟交互的车厢可能被使用。