BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu
Özet
BoTest Matrix botulinum nörotoksin (BoNT) algılama deneyleri hızla arındırmak ve numune matrisleri bir dizi BoNT'yi ölçmek. Burada, katı ve sıvı matrislerden BoNT tayini ve ölçümü için bir protokol mevcut ve BOTOX, domates ve süt ile deneyi göstermektedir.
Abstract
Doğru tespiti ve karmaşık matrisler botulinum nörotoksininden (BoNT) ölçümü ilaç, çevresel ve gıda örnek test için gereklidir. Doğru gücü test BoNT-bazlı ilaç ürün üretim ve hasta güvenliği için gerekli ise, gıda maddelerinin hızlı BoNT'den testi salgını adli tıp, hasta tanı ve gıda güvenliği test sırasında gereklidir. BoNT testi için yaygın olarak kullanılan fare biyodeney son derece hassas ama hızlı ve rutin BoNT'den test için gerekli hassasiyet ve üretim yoksun. Ayrıca, hayvanların bioassay kullanımı BoNT'den test için fare biyodeney yerine ABD ve yurtdışında uyuşturucu ürün düzenleyici otoriteler ve hayvan hakları savunucuları tarafından aramalar sonuçlandı. Birçok in vitro tahliller yerine basit tamponlar içinde saflaştırılmış BoNT ile iyi çalışır geliştirilmiştir, ama en çok karmaşık matrisler test edilmesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Burada, tespit edilmesi için bir protokolBoTest Matrix tahliller kullanılarak kompleks matrislerde BoNT sunulmuştur. Deney üç bölümden oluşur: ilk bölümü test için numune hazırlanmasını gerektirir, ikinci bölümü matris BoNT'yi arındırmak için bir anti-BoNT antikor kaplı paramanyetik boncuklar kullanarak bir immunopresipitasyon adımdır, ve üçüncü bölümü izole BoNT en proteolitik rakamlarla Bir florogenik raportör kullanılarak faaliyet. Protokol, sıvı ve katı hem matrisler kullanılarak 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli testler için yazılı ve 4-26 saat arasında, toplam deney katı numune türü, toksin yükü ve arzu edilen duyarlılığına bağlı olarak manuel preparatın yaklaşık 2 saat gerektirir. Veriler, fosfat tamponlu tuzlu su, bir ilaç ürünü, kültür yüzer,% 2 süt, taze domates ile BoNT / A test için sunulan ve deney başarısı için kritik bir parametre içeren bir tartışma vardır.
Introduction
Botulinum nörotoksinler (BoNTs) 1-3 ng tahmin damar insan öldürücü dozları ile bilinen en ölümcül maddelerdir / 1,2 kg arasındadır. BoNT yedi serotip yapısal olarak benzer, her bir hücre, bir çinko endopeptidaz 3-5 kodlayan sitosol ve bir hafif zincir içine alımı ve translokasyon bağlanması için sorumlu bir ağır zincir alanı kapsayan, biri, G olarak etiketlenmiş. BoNT'nin nefis toksisite kısmen, sonuçları, nöromüsküler kavşağı 6 motor nöronların içine kendi özgül bağlanma ve giriş. Bir kez nöron içinde, hafif zincir endopeptidaz spesifik olarak ayrıştıran, çözünür N-etilmaleimit duyarlı faktör bağlanma protein reseptörü (SNARE) vesikül füzyonu için gerekli proteinler, bir veya daha fazla, nörotransmitter salımını inhibe ve gevşek felce 7-14 yol açar. Yaygın hastalığı "botulizm" BoNT'nin tarafından diyafram ve interkostal kasların felci olarak bilinen sonuçta sonuçlarıErken tanı ve tedavi sürece solunum yetmezliği ve ölüm alınır.
İnsan gıda kaynaklı botulizm en yaygın BoNT'den serotip A, B, E ile ilişkili ve genellikle F (BoNT / A, BoNT / B, vb) ve kontamine gıda 15,16 yenmesi sonucu oluşur, ancak yara botulizm birçok davada intravenöz uyuşturucu kullananlar 17,18 arasında rapor edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri'nde, bir yaşın altındaki çocuklar tarafından Clostridium sporlarının alımından kaynaklanan bebek botulizm botulizm 19-21 en sık görülen şeklidir. Ancak, yanlış ev konserve ve gıda işleme kaynaklanan gıda kaynaklı salgınların BoNT'den yurtdışında Amerika Birleşik Devletleri ve hem de bildirildi. 2000-2009 yılları arasında, gıda kaynaklı botulizm en az 338 olgu altı ölümlerin 22 olmak üzere dünya çapında bildirildi. Hızlı ve hassas gıda kaynaklı botulizm salgınları tespit yeteneği erken tanısına yardımcı olabilecek bir kritik göstergesidir 23,24. Ayrıca, maliyet-etkin ve rutin gıda test izin algılama yöntemleri geliştirilmiş gıda güvenliği sağlayacaktır.
BoNT nöronal özgüllük ve uzun biyolojik yarı ömrü, aynı zamanda güçlü bir tedavi sağlar. Amerika Birleşik Devletleri'nde, BoNT bazlı ilaçlar kozmetik koşulları ve kaş hatları, servikal distoni, migren baş ağrısı, aşırı aktif mesane, ve şaşılık içeren nöromüsküler ile ilgili hastalıkların tedavisi için Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır. Çok sayıda "off-label" uygulamalar şiddetli kas disfonksiyonu 25-28 için yüksek doz tedaviler de dahil olmak üzere, belgelenmiştir. Doz aşımı potansiyel zararlı yan etkileri hastaları risk altına sokar iken düşük dozun etkisiz tedaviye neden olabilir Doğru toksin ölçümü, doğru doz için önemlidir. Ne yazık ki, hiçbir standart gücü tahlil protokolü BoNT-bazlı ilaç süreden arasında birim tanımı eşitsizlikler sonucunda, üreticiler arasında paylaşılırcts 29-31.
BoNT için standart deney BoNT içeren örnekler farelere intraperitoneal olarak enjekte edilmiş ve ölüm sayıları 1-7 gün boyunca 16,32,33 kaydedildiği fare deneyidir. Fare biyodeney 5-10 pg BoNT / A 34 algılama sınırları (LOD) ile çok hassas olmakla birlikte, hayvan kullanımı üzerinde etik kaygılar, yüksek eğitim personelinin maliyeti ve hayvan tesisleri, uzun tahlil kez, ve eksikliği sürdürülmesi standartlaştırılmış protokoller standartlaştırılmış, hayvan ücretsiz BoNT'den test ve ölçüm yöntemlerinin 35-39 geliştirmek aramalar sonuçlandı. Son zamanlarda, çeşitli alternatif BoNT'den ölçümü yöntemleri fareyi veya yakınındaki-fare biyodeney hassasiyetini 40-49 sunuyoruz geliştirilmiştir. Bu yöntemler yaygın olarak floresan, kütle-spektrometresi, veya immünolojik yöntemleri kullanmak ve hayvan kullanmadan fare biyolojik deneyi daha kısa deney süresine sahiptir. Kütle spektrometrisi immünolojik techniq kombine yaklaşımlarUes algılamak ve BoNT'den gıda ve diğer karmaşık numunelerde bulunan ölçmek gösterilmiştir, ancak, personel eğitim gereksinimleri ve özel ekipman limiti bu deneyler 50-55. Diğer birçok alternatif deneyler, kompleks numune test kolayca uygulanabilir değildir ya da rutin BoNT test için gerekli olan hacmi yoksundur. BoNT aşırı gücü maç için duyarlılık ile in vitro deney yöntemleri geliştirmek çalışırken gıda örneği viskozite, pH, tuz içeriği ve matris bileşenlerinin son derece değişken doğası özellikle zor bir zorluktur. Ayrıca, bu tür BoNT bazlı ilaç ürünleri yeniden süspansiyon haline getirilmesinden kaynaklanan gibi daha basit ve nispeten iyi huylu tampon sistemleri, önemli in vitro BoNT gücü 56 etki tuzu, albumin ve şeker stabilizatörler (örneğin, katkı maddeleri) içerebilir. Toksin arıtma örnekler 56-59 en basit ama doğru aktivitesi test etmek için gereklidir.
BoTest Matrix deneyleri hızlı, yüksek verimlilik için tasarlanmış ve yaygın araştırma laboratuvarlarında 56,60 bulunan ekipman kullanılarak karmaşık örneklerinden BoNT'nin tutarlı ölçümü yapılmıştır. Bu deneyler kovalent olarak bağlamak ve bir numune dışarı BoNT'yi ayırmak ve daha sonra yıkanarak matris müdahale bileşikleri çıkarmak için serotip spesifik anti-BoNT antikorları ile bağlantılı para-manyetik boncuk kullanır. Yıkamanın ardından, bağlı BoNT proteolitik aktivitesi daha sonra BoNT serotip test edilen ile uyumlu bir raportör kullanılarak optimize edilmiş bir reaksiyon tampon maddesi içinde ölçülür. Bu muhabir bir N-terminal siyan flüoresan protein (CFP) yarımı oluşturan bir alt-tabaka BoNT, SNAP25 kalıntıları 141-206 veya sinaptobrevin kalıntıları 33-94 ile bağlantılı bir C-terminal sarı floresan protein türevi (Venus) yarımı kapsayan florojenik proteinlerdir BoTest A / E veya B / D / F / G gazetecilere, sırasıyla 45. BoNT ile Reporter yarılma Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak izlenir. Ne zaman tO muhabir CFP uyarma OBP emisyonu ve heyecan verici Venüs emisyonu söndürme, Venüs FRET sonuçları, bozulmamış. BoNT ile muhabir yarılması CFP yayma ve Venus emisyonunda azalma bir artışa yol açan, FRET önler. BoNT aktivitesi daha sonra kantitatif olarak CFP ve Venüs emisyon oranı kullanılarak ölçülebilir. 3 pg altında LOD yüksek verimli bir 96-yuvalı plaka formatı kullanılarak 56 yiyecekler çok geniş bir yelpazede mümkündür. Tahlil, kürecik yüzeyinde toksin konsantrasyonu sağlar çünkü artan duyarlılık daha büyük örnek hacimleri kullanılarak elde edilebilir.
BoNTs A, B, E ve F için BoTest Matrix deneyleri geliştirilmiş ve gıda, ilaç ve çevresel numuneler 56,60 ile test edilmiştir. Burada, (örneğin ilaç, BoNT tamponu içinde) ve yüksek karmaşıklık (örneğin gıda, çevre) örnekleri düşük karmaşıklık BoNT saptanması için bu deneyleri yürütmek için işlemleri tarif eder. Belirli işleme yöntemleriBirkaç örnek türleri bu protokolde ele ve burada tarif değil örnek türleri genellikle sunulan yöntemleri bir arada kullanılarak adapte edilebilir için. Protokol geliştirilmiş ve test BoNT / A ile değil, başka bir yerde 56,60 gösterildiği gibi, ilgili deneyler kullanılarak diğer BoNT serotiplerine uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol BoNT'yi / karmaşık matrisler bir kompleks, holotoksin veya Clostridium kültür süpernatant ölçülmesi için prosedürler açıklanmaktadır. Deney hassasiyeti serotipleri ve tahliller arasında değişir, ancak ilgili Matrix deneyleri 56,60 diğer BoNT serotipleri (örneğin, BoNT / B, E, ve F) test sırasında protokol, ancak, aynıdır. Bu protokol olası numune her türü için hesap değil ve bazı modifikasyonlar belirli örnek kompozisyon ve arzu edilen uygulamaya…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar değerli tartışmalar ve tavsiye için H. Olivaresi ve D. Ruge teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF SBIR ödülü (BioSentinel Inc IIP-1127245) ve Savunma Bakanlığı sözleşme (BioSentinel Inc W81XWH-07-2-0045) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit | BioSentinel | A1015 | Detection kits for BoNT/B and F are also available. |
| Varioskan Flash fluorescence microplate reader | Thermo-Fisher Scientific | 5250040 | Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used. |
| 96-well Magnetic Bead Separation Plate | V&P Scientific | VP771H | Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well. |
| Magnetic Bead-Compatible Plate Washer | BioTek | ELx405 VSRM | Optional, only required for automated plate washing. Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use. |
| Microcentrifuge | Various | N/A | Optional, only required for samples needing centrifugation. |
| MixMate plate mixer | Eppendorf | 22674200 | |
| Orbital Shaker | Various | N/A | Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available |
| EDTA-free Protease Inhibitor Tablets | Roche | 4693132001 | Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free. |
| BoNT/A | Metabiologics | N/A | Optional, only required for standardization and quantification purposes |
| Black, Flat-bottomed 96-well Plates | NUNC | 237105 | Plates should not be treated |
| 96-well Plate Sealing Tape | Thermo Scientific | 15036 |
Referanslar
- Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
- Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
- Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
- Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
- Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
- Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
- Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
- Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
- Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
- Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
- Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
- Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
- Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
- Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
- Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
- Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
- Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
- Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
- Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
- Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
- Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
- Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
- Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
- Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
- Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
- Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
- Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
- Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
- Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. . Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
- . AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
- Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
- Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
- . Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
- . Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
- Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test – problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
- Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
- Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
- Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
- Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
- Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
- Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
- Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O’Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
- Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
- Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
- Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
- Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
- Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
- Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
- Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
- Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
- Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
- Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
- Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
- Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Mikrobiyoloji. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
- Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
- Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
- Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
- Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
- Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
- Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
- Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
- Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
