Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg ^1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan ​​elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase ^3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding ^6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) proteïnen vereist voor vesikel fusie, remmende neurotransmitter en leidt tot zwakke verlamming ^7-14. Algemeen bekend als de ziekte 'botulisme, "verlamming van het diafragma en tussenribspieren door BoNT uiteindelijk totrespiratoire insufficiëntie en de dood, tenzij een vroege diagnose en behandeling zijn ontvangen.

Menselijke voedselbotulisme wordt meestal geassocieerd met BoNT serotypen A, B, E en F (BoNT / A, BoNT / B, enz.) en meestal het gevolg van de inname van besmet voedsel ^15,16, hoewel verscheidene gevallen wondbotulisme werden gemeld bij intraveneuze druggebruikers ^17,18. In de Verenigde Staten, infantiel botulisme als gevolg van de inname van Clostridium sporen door kinderen onder de leeftijd van een is de meest voorkomende vorm van botulisme ^19-21. Echter, door voedsel overgedragen BoNT uitbraken als gevolg van onjuist thuis inblikken en verwerking van levensmiddelen werden gemeld in zowel de Verenigde Staten en in het buitenland. Tussen 2000-2009 werden ten minste 338 gevallen van voedselbotulisme wereldwijd gemeld waaronder zes dodelijke slachtoffers ^22. De mogelijkheid om voedselbotulisme uitbraken snel en gevoelig op te sporen is een kritische indicatie dat een vroege diagnose zou kunnen helpen ^23,24. Bovendien zal detectiemethoden die kosteneffectief en routinematig testen van voedsel laten leiden tot een betere voedselzekerheid.

Neuronale specificiteit en lange biologische halfwaardetijd BoNT maakt het een krachtige therapeutische ook. In de Verenigde Staten, zijn BoNT-gebaseerde geneesmiddelen goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cosmetische voorwaarden en-neuromusculaire-gerelateerde aandoeningen, waaronder glabellalijnen, cervicale dystonie, migraine, overactieve blaas, en scheelzien. Tal van "off-label"-toepassingen zijn gedocumenteerd, met inbegrip van hoge-dosis behandelingen voor ernstige spier-disfunctie ^25-28. Nauwkeurige kwantificering toxine is essentieel voor een juiste dosering, als onderdosering kan leiden tot ineffectieve behandeling, terwijl overdosering brengt patiënten met een risico van potentieel schadelijke bijwerkingen. Helaas is er geen gestandaardiseerde potentie assayprotocol gedeeld over fabrikanten, wat resulteert in eenheid definitie ongelijkheid tussen BoNT-based drug products ^29-31.

De standaard test voor BoNT de muizen bioassay waarin BoNT-houdende monsters intraperitoneaal worden geïnjecteerd in muizen en het aantal sterfgevallen geconstateerd gedurende 1-7 dagen ^16,32,33. De muis bioassay is zeer gevoelig met detectielimiet (LOD) van 5-10 pg BoNT / A ^34, maar de ethische bezorgdheid over het gebruik van dieren, de hoge kosten van de opleiding van personeel en het onderhoud dier faciliteiten, lange assay keer, en het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen geleid tot oproepen om gestandaardiseerde, diervrije BoNT testen en kwantificeringsmethoden ^35-39 ontwikkelen. Onlangs werden een aantal alternatieve BoNT kwantificeringsmethoden ontwikkeld die muis of bijna-bioassay gevoeligheid ^40-49 bieden. Deze methoden vaak gebruikt fluorescentie, massa-spectrometrie, of immunologische methoden en bieden testtijden aanzienlijk korter dan de bioassay in muizen zonder dierproeven. Massaspectrometrie benaderingen gecombineerd met immunologische techniqwaarden bleken te detecteren en kwantificeren BoNT in voedsel en andere complexe monsters, maar de opleiding van personeel eisen en gespecialiseerde apparatuur limiet deze assays ^50-55. De meeste andere alternatieve tests zijn niet direct van toepassing op complexe steekproeven of missen de doorvoer nodig is voor routine BoNT testen. De sterk variabele aard van voedsel monster viscositeit, pH, zoutgehalte, en matrixbestanddelen presenteert een bijzonder moeilijke uitdaging wanneer het proberen om in vitro assay methodes met gevoeligheid voor de extreme kracht van BoNT overeen te ontwikkelen. Zelfs eenvoudige en relatief goedaardige buffersystemen, zoals die welke voortvloeien uit resuspensie van BoNT gebaseerde geneesmiddelen bevatten zout, albumine, suiker en stabilisatoren (bijvoorbeeld excipiënten) die grote invloed in vitro potentie BoNT ^56. Toxine zuivering vereist voor nauwkeurige activiteit testen van alle maar de eenvoudigste monsters ^56-59.

DeBoTest Matrix testen werden ontworpen voor een snelle, high-throughput, en consistente kwantificering van BoNT van zeer complexe monsters met behulp van apparatuur vaak gevonden in onderzoekslaboratoria ^56,60. Deze testen gebruiken paramagnetische kralen covalent gebonden aan serotype-specifieke anti-BoNT antilichamen te binden en afzonderen BoNT uit een steekproef en verwijder storende matrix verbindingen door wassen. Na het wassen wordt gebonden BoNT proteolytische activiteit dan gekwantificeerd in een geoptimaliseerde reactie buffer met behulp van een verslaggever compatibel met de BoNT serotype wordt getest. Deze reporters fluorogene eiwitten bestaande uit een N-terminale cyaan fluorescerend eiwit (CFP) deel en een C-eindstandige geel fluorescerend proteïne derivaat (Venus) groep verbonden door een BoNT substraat, SNAP25 residuen 141-206 of synaptobrevin residuen 33-94 die de BoTest A / E of B / D / F / G verslaggevers, respectievelijk ^45. Reporter splitsing door BoNT wordt bewaakt door middel Förster resonance energie-overdracht (FRET). Als thij verslaggever is intact, excitatie van GVB resulteert in FRET naar Venus, afschrikken GVB emissie en spannende Venus emissie. Splitsing van de reporter door BoNT FRET voorkomt, wat leidt tot een toename GVB emissie en afname Venus emissie. BoNT activiteit kan dan kwantitatief worden gemeten met behulp van de verhouding van het GVB en Venus uitstoot. LOD onder 3 pg mogelijk uit een breed scala van voedingsmiddelen met behulp van een high-throughput 96-well plaat formaat ^56. Verhoogde gevoeligheid kan worden verkregen met grotere monstervolumes aangezien de test maakt concentratie van het toxine op de korrel oppervlak.

De BoTest Matrix assays voor Bonts A, B, E, en F werden ontwikkeld en getest met voedings-, farmaceutische, en milieu-monsters ^56,60. Hier beschrijven we de procedures voor het uitvoeren van deze tests voor de detectie van BoNT lage complexiteit (bijv. farmaceutische, BoNT in buffer) en grote complexiteit (bijvoorbeeld voeding, milieu) monsters. Specifieke verwerkingsmethodenvoor verschillende soorten monsters worden in dit protocol en soorten monsters hier niet beschreven kan meestal worden aangepast met behulp van een combinatie van de gepresenteerde methoden. Het protocol is ontwikkeld en getest met BoNT / A, maar is aan te passen aan andere BoNT serotypen middel van hun respectieve testen zoals elders ^56,60 aangetoond.