隔离和肉毒杆菌神经毒素定量从复杂的基质使用BoTest矩阵测定

肉毒杆菌神经毒素毒素（BoNTs）是已知的最致命的物质，估计在1-3纳克静注人致死剂量/公斤^1,2。七结构相似的肉毒毒素血清型，至G标记为A，存在，每个由负责细胞结合，摄取和易位到细胞质和轻链编码一种锌内肽酶^3-5的重链结构域。肉毒毒素的毒性精美的结果，在某种程度上，在神经肌肉接头⁶的特异性结合并进入运动神经元。神经元一旦进入，所述轻链肽酶特异性切割1的可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体（SNARE）所需的囊泡融合蛋白的一个或多个，抑制神经递质的释放，并导致弛缓性麻痹^7-14。俗称疾病“肉毒杆菌”的膈肌和肋间肌由肉毒毒素麻痹，最终导致呼吸衰竭而死亡，除非早期诊断和治疗被接收。

人类食源性肉毒中毒是最常见的肉毒毒素血清型A，B，E关联，和F（肉毒毒素/ A，肉毒毒素/ B 等 ），通常从污染的食物^15,16摄入导致，虽然，伤口肉毒中毒的几种情况据报道其中静脉吸毒者^17,18。在美国，从梭状芽孢杆菌孢子的一岁以下儿童的摄入导致婴儿肉毒中毒是肉毒杆菌^19-21的最常见形式。然而，不当家罐头和食品加工产生的食源性肉毒毒素暴发的报道同时在美国和海外。与2000-2009年至少 ​​有338例食源性肉毒中毒的报道世界各地，包括六人死亡^22。快速和灵敏地检测食源性肉毒中毒爆发的能力是可能帮助早期诊断的重要指标^23,24。此外，检测方法，使成本效益和常规食品检测将导致改善粮食安全。

肉毒毒素的神经元特异性和长的生物半衰期也使得它成为有效的治疗。在美国，肉毒毒素类药物被美国食品与药物管理局的化妆品条件和神经肌肉有关的疾病，包括眉间纹，颈部肌张力障碍，偏头痛，膀胱过度活动症，以及斜视治疗通过。众多的“关闭标签”的应用被记录，包括高剂量治疗重症肌功能不全^25-28。准确的毒素定量是正确的剂量至关重要，因为剂量不足可能导致治疗无效，而超剂量将患者置于潜在的有害副作用的风险。不幸的是，没有标准的效价测定的协议不同制造商之间共享，从而导致肉毒毒素为基础的药物机生产线设备之间的不平等定义仙^29-31。

标准测试肉毒毒素是小鼠生物法，其中含肉毒毒素样品腹腔注射到小鼠和死亡的人数录得超过1-7天^16,32,33。小鼠生物检测与检测5-10皮克的BoNT / A ³⁴限（LOD）非常敏感，但道德问题了动物的使用，培养人才的成本高，维护动物的设施，长期的分析时间，而且缺乏标准化的协议导致的呼叫建立标准化，无动物肉毒毒素检测和定量方法^35-39。最近，一些替代肉毒毒素定量方法的发展，提供鼠标或近小鼠生物检测的灵敏度^40-49。这些方法通常使用的荧光，质谱，或免疫学方法，并提供检测时间比不使用动物的小鼠生物法大大缩短。质谱办法结合免疫techniq的UE却显示出了检测和量化的BoNT包含在食品和其他复杂的样品，但是，人员的培训要求，专门的设备限制这些测定^50-55。大多数其他替代分析是不容易适用于复杂样品测试或缺乏所需的日常肉毒毒素测试的吞吐量。试图开发在体外试验方法的敏感性，以配合肉毒毒素的极端效力时的食品样品的粘度，pH值，含盐量和基质成分的高度可变的性质提出了一个特别困难的挑战。此外，即使是简单和相对良性的缓冲系统，如那些从肉毒毒素为基础的药物产品的再悬浮产生的，含有盐，白蛋白，糖和稳定剂（ 即赋形剂），该显著影响的体外效力的BoNT ^56。毒素净化所需的所有准确的活性测试，但最简单的样品^56-59的。

该BoTest矩阵分析被设计用于快速，高通量，和肉毒毒素的使用设备在研究实验室^56,60通常发现高度复杂样品一致的定量。这些测定中使用的顺磁珠共价连接到血清型特异性抗肉毒毒素的抗体结合和隔离的BoNT出样品，然后除去洗涤干扰矩阵的化合物。洗涤后，肉毒毒素结合蛋白水解活性，然后量化使用的肉毒毒素血清型进行测试兼容记者优化的反应缓冲液。这些记者是荧光蛋白质组成的N-末端青色荧光蛋白（CFP）部分和C-末端的黄色荧光蛋白衍生物（金星）部分由一个基底的BoNT，SNAP25残基141-206或残基突触33-94相连构成的BoTest A / E或B / D / F / G记者，分别为^45。记者裂解肉毒毒素是用福斯特共振能量转移（FRET）进行监测。当t他记者是完整的，CFP的激发导致FRET金星，淬火CFP排放和令人兴奋的金星发射。记者通过肉毒毒素的裂解防止荧光共振能量转移，导致增加CFP排放和减少排放的金星。肉毒毒素活性可再使用CFP和金星排放量的比例来定量测定。 LOD低于3皮克有可能从广泛的使用高通量的96孔板格式⁵⁶的食品。更高的灵敏度可以使用更大的样本量来获得，因为试验允许在磁珠表面毒素的浓度。

对于BoNTs A，B，E和F的BoTest矩阵分析被开发，并与食品，制药，环境样品^56,60测试。在这里，我们描述了执行这些分析的肉毒毒素在低复杂度的检测（ 如制药，肉毒毒素在缓 ​​冲液）和高复杂性（ 如食物，环境）的样本程序。具体的处理方法几个样品类型，将在本协议并在这里没有描述的样品类型通常可以使用的呈现方法的组合调整。该协议的开发和测试了肉毒毒素/ A，但适应于其他血清型肉毒毒素使用各自的试验为证明别处^56,60。