العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ ^1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك ^3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية ^6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات (فخ) البروتينات اللازمة لحويصلة الانصهار، مما يعوق الافراج عن العصبي ويؤدي إلى الشلل الرخو ^7-14. والمعروف باسم مرض "التسمم الغذائي"، شلل الحجاب الحاجز والعضلات الوربية التي كتبها بونت يؤدي في النهاية إلىوردت فشل الجهاز التنفسي والموت ما لم التشخيص المبكر والعلاج.

ويرتبط المنقولة بالغذاء الإنسان التسمم الغذائي الأكثر شيوعا مع بونت الأنماط المصلية A، B، E، F و(بونت / A، بونت / B، الخ) وعادة ما ينتج عن تناول الأغذية الملوثة ^15،16، على الرغم من، العديد من حالات التسمم الغذائي الجرح ولم يبلغ عن وبين متعاطي المخدرات عن طريق الحقن الوريدي ^17،18. في الولايات المتحدة، والتسمم الرضع الناتجة عن ابتلاع الجراثيم كلوستريديوم من قبل الأطفال الذين تقل أعمارهم عن واحد هو الشكل الأكثر شيوعا من التسمم الغذائي ^19-21. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن تفشي المنقولة بالغذاء بونت الناتجة عن غير لائق تعليب المنزل وتجهيز الأغذية في كل من الولايات المتحدة والخارج. بين 2000-2009، تم الإبلاغ عن 338 حالة على الأقل من التسمم المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك ستة قتلى ^22. القدرة بسرعة وحساسية للكشف عن تفشي التسمم الغذائي المنقولة عن طريق الأغذية هو مؤشر الحرجة التي يمكن أن تساعد التشخيص المبكر ^23،24. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الكشف التي تسمح فعالة من حيث التكلفة واختبار الأغذية الروتينية تؤدي إلى تحسين الأمن الغذائي.

خصوصية بونت في الخلايا العصبية وطويلة العمر النصفي البيولوجي أيضا يجعلها العلاجية القوية. في الولايات المتحدة، يتم الموافقة على المخدرات استنادا بونت من قبل إدارة الغذاء والدواء لعلاج الحالات مستحضرات التجميل والاضطرابات العصبية والعضلية ذات الصلة بما في ذلك خطوط المقطب، خلل التوتر عنق الرحم، والصداع النصفي، وفرط نشاط المثانة، والحول. يتم توثيق العديد من التطبيقات "غير الرسمي"، بما في ذلك العلاجات جرعة عالية لضعف شديد في العضلات ^25-28. دقيقة السم الكمي هو أمر حاسم لالجرعات الصحيحة، كما underdosing قد يؤدي إلى العلاج غير فعال بينما الجرعة الزائدة يضع المرضى المعرضين لخطر الآثار الجانبية الضارة المحتملة. للأسف، يتم تقاسم أي بروتوكول رجولية فحص موحدة عبر الشركات المصنعة، مما أدى إلى عدم المساواة بين الم Ù حدة تعريف المخدرات استنادا بونت-سنت ^29-31.

معيار اختبار لبونت هو الأحيائي الماوس التي يتم حقن عينات بونت التي تحتوي على الغشاء البريتونى في الفئران وأعداد الوفيات المسجلة خلال 1-7 أيام ^16،32،33. الأحيائي الماوس حساس جدا مع حدود الكشف (اللد) من 5-10 خريج بونت / A ^34، ولكن المخاوف الأخلاقية على استخدام الحيوانات، والتكلفة العالية لتدريب الموظفين والحفاظ على مرافق الحيوان، مرات الفحص طويلة، وعدم وجود أدت بروتوكولات موحدة في المكالمات لتطوير موحدة، خالية من الحيوان بونت الاختبار وطرق القياس الكمي ^35-39. مؤخرا، تم تطوير عدة أساليب القياس الكمي بونت البديلة التي توفر الماوس أو شبه الماوس الأحيائي حساسية ^40-49. هذه الأساليب عادة ما تستخدم مضان، مطياف الكتلة، أو أساليب المناعية وتقديم مرات الفحص أقصر بكثير من الماوس الأحيائي بدون استخدام الحيوانات. مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع النهج techniq المناعيةعرضت شركة نظام الطاقة الموحد لكشف وتحديد بونت الواردة في المواد الغذائية وعينات أخرى معقدة، ولكن، ومتطلبات تدريب الموظفين والحد من المعدات المتخصصة هذه المقايسات ^50-55. معظم فحوصات أخرى بديلة غير قابلة للتطبيق بسهولة لاختبار عينة معقدة أو تفتقر إلى الإنتاجية المطلوبة للاختبار الروتيني بونت. طبيعة متغير بدرجة كبيرة من اللزوجة عينة الغذاء، ودرجة الحموضة ومحتوى الملح، ومكونات المصفوفة يمثل تحديا صعبا خصوصا عندما تحاول تطوير أساليب الفحص في المختبر مع حساسية لتتناسب مع قوة متطرفة من بونت. وعلاوة على ذلك، حتى الأنظمة الوقائية بسيطة وحميدة نسبيا، مثل تلك الناجمة عن إعادة تعليق من المنتجات القائمة على المخدرات بونت، تحتوي على الملح، والزلال، والسكر مثبتات (أي السواغات) التي تؤثر بشكل كبير في المختبر بونت رجولية ^56. مطلوب تنقية السم لاختبار دقة النشاط من جميع ولكن أبسط من عينات ^56-59.

الوقد صممت BoTest المقايسات مصفوفة لالسريع، والإنتاجية العالية، وتقدير ثابت من بونت من عينات معقدة للغاية باستخدام المعدات التي توجد عادة في مختبرات البحوث ^56،60. هذه المقايسات استخدام حبات ممغطس مرتبطة تساهميا لالمصلي محددة الأجسام المضادة للبونت لربط وعزل بونت من عينة ثم قم بإزالة التدخل مركبات المصفوفة عن طريق الغسيل. بعد الغسيل، ثم يتم كميا المقيدة النشاط بروتين بونت في رد فعل العازلة الأمثل باستخدام مراسل متوافقة مع النمط المصلي بونت التي يجري اختبارها. هذه هي بروتينات صحفيين الفلورة تتكون من السماوي N-محطة البروتين الفلوري (CFP) شاردة وبروتين فلوري الصفراء المشتقة-C محطة (فينوس) شاردة ويربطها به الركيزة بونت، وبقايا SNAP25 141-206 أو بقايا synaptobrevin 33-94 تشكل BoTest A / E أو B / D / F للصحفيين / G، على التوالي ^45. ويتم رصد مراسل الانقسام من قبل بونت باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق). عندما رانه مراسل سليمة، إثارة CFP النتائج في الحنق الى كوكب الزهرة، التبريد والانبعاثات CFP الانبعاثات فينوس مثيرة. الانقسام لمراسل بواسطة بونت يمنع الحنق، مما يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات CFP وانخفاض في الانبعاثات فينوس. ويمكن بعد ذلك أن يقاس النشاط بونت كميا باستخدام نسبة من انبعاثات CFP والزهرة. اللد أقل من 3 خريج ممكنة من مجموعة واسعة من الأطعمة باستخدام 96 جيدا شكل عالية الإنتاجية لوحة ^56. ويمكن الحصول على زيادة الحساسية باستخدام حجم العينة أكبر منذ مقايسة يسمح تركيز السامة على سطح حبة.

تم تطوير المقايسات مصفوفة BoTest لBoNTs A، B، E، F واختبارها ومع المواد الغذائية والأدوية، والعينات البيئية ^56،60. هنا، نحن تصف إجراءات لتنفيذ هذه المقايسات للكشف عن بونت في التعقيد منخفضة (مثل الأدوية، وبونت في المخزن) وعالية التعقيد (مثل المواد الغذائية والبيئية) العينات. طرق المعالجة محددةلتتم معالجتها عدة أنواع العينة في هذا البروتوكول، وأنواع العينات وليس وصفها هنا عادة ما يمكن تكييفها باستخدام مزيج من الأساليب المقدمة. وقد تم تطوير بروتوكول واختبارها مع بونت / A ولكن قابلة للتكيف مع الأنماط المصلية بونت أخرى باستخدام المقايسات الخاصة بها كما هو موضح في أماكن أخرى ^56،60.