レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

マウスの麻酔、安楽死、および心臓灌流に関してここに記載されている手順は、イェール大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルの下で行われた。 1. RNaseフリーの機器およびソリューションの準備 RNaseはベンチの上、マイクロピペットおよび調査者を含むすべての実験室表面の共通の汚染物である。 頻繁にまたは定期的にRNAE除染溶液で手袋を拭きます。 ステンレス鋼解剖ツールとガラス製品は、>200°Cで1時間以上加熱することでRNaseを自由にすることができます。注:蒸気滅菌はRNaseを破壊しません。または、RNase除染溶液で拭き取り、次にRNaseフリーの70%エタノールと空気乾燥で拭きます。 ベンチトップ、RNase除染液を用いた他のラボ表面およびマイクロピペレットを拭き取り、RNaseフリー70%エタノールで拭きます。RNAの回収および分析のために特定のラボベンチまたは作業領域を指定します。注: ピペットのシャフトを拭く前にチップ エジェクタを取り外し、可能であれば、チップ エジェクタを取り外します。 メーカーがRNaseフリーであると認定したチューブ、マイクロ遠心チューブ、ピペット、マイクロピペットチップを使用してください。非常に低い結合の先端およびマイクロチューブの使用は推薦される。可能であれば、開けたばかりの箱や袋を使用し、一般的なラボの供給から分離してください。 市販のソースからRNaseフリー溶液(Dulbeccoのカルシウム及びマグネシウムフリーPBS(PBS)、エタノール、RNaseフリー70%エタノール)を得る。実験ごとに新しく開いたボトルを使用します。 Azure B 色素のソースは、無傷の RNA の正常な回復に不可欠です。染色と収集に貴重なサンプルをコミットする前に、色素の各バッチをテストします。非実験動物から数千個のニューロンを収集し、RNAを調製し、以下に説明するRNAの完全性を決定して、8.5を超えるRIN番号を一貫して生成するものを見つけます。 アズールB染料(1%、wt/vol)をRNaseフリー70%エタノールに溶解し、通常は0.3gの30mlエタノールを50ml遠心管に溶解します。RTで一晩、またはすべての粒子が溶解するまでロッカーによく混ぜます。この溶液の1つの管は、染色強度に影響を与えることなく、複数のスライドを染色するために使用することができる。 予防措置として、生物学的複製ごとに異なる染色管を使用してください。 クリオマールとO.C T.を使用して、それ以上の治療を行わずにコードセクションを埋め込みます。 クライオスタットを-20~-24 °Cに保ちます。 切り離し後、十分な数が準備されるまで、スライドを-80°Cの冷凍庫に入れる。スライドが作成された後、できるだけ早くRNAの準備を開始します。長期保管の場合は、スライドではなく、セクションを外すか部分的に切り離したOCTブロックを80°Cに保ちます。 その指示に従ってRNA調製キットの製造業者によって提供される解決を使用して解剖された運動ニューロンからのRNAの準備のためのグアニジンチオシアネートの緩衝液を作る。 マウスからの脊髄切片の作製(図1A) RNase除染溶液で焼いたり拭いたりして、解剖ツール、ガラススライド、カミソリブレード、解剖プラットフォームをすべて洗浄し、RNaseフリーの70%エタノールを洗浄します。2分間乾燥させます。ラボワイプで覆うことで、ほこりのないすべてを保ちます。 麻酔、心臓灌流、安楽死を含む動物の取り扱い手順は、脊髄解剖の時点に動物を迅速に持ち込むことを目的として、地元の制度的動物のケアおよび使用委員会(IACUC)の要件に従って行われるべきである。 腹腔内(ip)ケタミン(450mg/kg)の致死量の注射によってマウスを麻酔する。 深いレベルの麻酔が達成され、つま先ピンチ応答の欠如によって確認されたら、マウス腹側を解剖プラットフォーム(発泡スチロールボードなど)に上に置き、胸腔を開いて心臓を露出させ、左心室(調査官の右にある)に注入セットの27G針蝶を挿入します。鋭利な鉗子で右心房をニックし、蠕動ポンプを使用して約2分間5〜7 ml /分の速度でPBSと浸透させる。この時点で、心房から流れる液体はほとんど血液を含まないべきである。 灌流針を取り外し、マウスの首を切り落とし、解剖板でひっくり返します。皮膚を開いて脊柱を露出させ、小さいはさみと鉗子を使って椎骨を取り除き、鋭い鉗子で神経根を切断しながら脊髄を持ち上げる。速度と練習は、コードの除去に灌流の開始から移動に不可欠です。これは7分以下でいてはならない。 残りの血液を洗い流すために、RNaseフリーの水でコードを10秒間洗い流します。湾曲した鉗子を持つRNaseフリーのガラススライドの上に脊髄を置きますが、すぐに。きれいなカミソリの刃を使って脊髄を横に9~10個に分けます。 同じ鉗子を使用してO.C.T.で満たされたクリオマールにピースを入れ、きれいな針を使用して垂直に整列します。液体窒素であらかじめ冷却した2-メチルブタンを含む浅いトレイに金型を入れ、そのトレイを液体窒素浴に入れて、RNAの分解を避けるために脊髄片を速く凍結します。 OCT組み込みブロックは-80 °Cで、断離前に最大6ヶ月間保管してください。コードの取り出しから凍結までのプロセスは、RNAの完全性を維持するために5分以内に行われるべきです。 O.C T.埋め込みブロックを-20°Cでクライオスタットで作製し、それぞれ9〜10個の脊髄切片を含む9-10の脊髄断面を含む、RNase-free PEN膜2 μmスライド上で、セクションがスライドに付着していることを確認するために最初は室温で保たれています。クライオスタット内の-20°C表面のセクションを直ちに再凍結します。スライドは使用するまで-80°Cに保ちます。 3. 脊髄切片の染色(図1A) クリーンラックに、50 mlの円錐チューブを6個配置します。25-30 mlのRNase-フリー70%エタノールですべてを充填し、スライドが浸漬されたときにスライド上のすべてのセクションを覆うのに深さが十分になるようにします。前述のとおり、1% の Azure B ソリューションを 30 ~35 ml にし、同じラックに保管して、洗浄または染色中にソリューションを変更する間の時間を最小限に抑えます。ラックの前に 3 つか 4 つのラボ ワイプを置いて、余分なソリューションを素早く排出します。 80°Cの冷凍庫からドライアイスにスライドを取り出します。手袋をした手のひらの上に置いて1枚のスライドを解凍します。スライドの水分と結露の大部分をラボワイプで拭き取り、セクションに触れないように注意してください。ペトリ皿に新鮮なシリカゲル乾燥剤の上にスライドを30〜40秒間完全に乾燥させます。実験室の湿度が高い場合、真空デシケーターでの短い処理は、より迅速にスライドを乾燥させるために使用することができます。 洗濯と染色。 乾燥したスライドをRNaseフリー70%エタノールの第1チューブに浸します。スライドを30秒間浸し、スライドを洗ってOCTを上下に45~60秒間浸します。スライドを溶液から取り出し、ラボワイプで余分な液体を排出します。スライドを70%エタノールの第2チューブに浸漬して同じ工程を繰り返します。脊髄部の周りのOCTが完全になくなっている場合は、3番目のチューブで洗浄を繰り返します。 余分な液体を排出した後、スライドを1%のAzure B溶液に70%RNaseフリーエタノールで30〜45秒間水没させます。ラボ ワイプで超過の Azure B を排出します。この時点で、スライド全体が青色になります。 70%エタノールの次のチューブにスライドを沈め、3〜4倍の速さで上下に浸して過剰な染料を除去し、特定の運動ニューロン染色を目に見えるようにします。セクションが非常に暗く染色された場合は、70%エタノールの新鮮なチューブで脱染色ステップを繰り返します。染色が軽すぎると思われる場合は、スライドを Azure B ソリューションに 30 秒間戻して、削除を繰り返します。余分なエタノールを拭き取り、すべての液体がなくなるまでスライドを〜40秒間乾燥させます。灰色の物質は水色になり、運動ニューロンは深い青色に染まるのに対し、見やすくなります。すぐに解剖を開始します。 4. レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LMD)(図1B) 顕微鏡をオンにし、チューブホルダーをアンロードして、サンプル採取用に0.6 mlマイクロフュージチューブのキャップを取り付けます。0.6 ml マイクロフュージチューブのキャップに 30 μl グアニジンチオシアネートライシスバッファーを入れます。ピペットチップを使用して溶液を広げ、キャップの表面を液体で覆います。このようにして、収集されたすべてのニューロンは解剖される水溶性溶液に溶解される。キャップを穴に合わせ、目的を顕微鏡ソフトウェアに合わせます。レーザーキャプチャを開始するまで、キャップを覆われた位置に保ちます。 空気乾燥スライドをLMD顕微鏡のステージ上に逆さまに置き、PENスライドの膜が下向きになるようにします。セクションを持つ膜は、その下にコレクションチューブである穴に面する必要があります。 スライドの準備を始める前に、レーザーを10分オンにしてください。5Xの目的を持つ脊髄部に焦点を当てます。解剖のための20Xの目的に移動します。 ライトペンで「ダミー」領域をマークし、レーザーがそれを収集せずにそれを切り取ることを可能にします。これによりPEN膜が弛緩し、連続して複数の領域をマークして切断することが可能になります。 腹側ホーン領域の運動ニューロンを再び焦点を合わせ、識別します。これらのニューロンは、その位置、ピラミッド型、その大きなサイズ、および Azure B による濃い青色染色によって認識されます (図 2)。 ライトペンを使用して描画ツールを選択し、モーターニューロンの端に沿ってマークを付け、完全なアウトラインを作成します。運動ニューロン以外の細胞からの汚染を避けるために、輪郭をできるだけ運動ニューロンに近づけるようにしてください。(レーザーカットラインの幅を確認するために事前にいくつかのセクションをテストし、必要に応じてクリアランスを調整します。切削する前に複数のセルをマークします。ソフトウェアは位置を記憶します。 キャップ位置をクリックして、キャップを切断位置の下に移動します。開始ボタンをクリックして、レーザーで運動ニューロンの解剖を開始します。1つのマイクロフュージチューブのキャップに1スライド上のすべてのセクションからすべての運動ニューロンを収集します。 収集が完了したら、トレイをアンロードし、チューブをそっと取り外してホルダーからマイクロフュージチューブを取り出します。溶液を上下にピペット処理して、運動ニューロンをバッファに完全に溶解します。4°Cで2分間14,000 x gで遠心してチューブの本体に溶液を移動させます。 試料を乾氷で直ちに冷凍し、-80°Cで保存してください。 このプロセスは、スライド染色から運動ニューロンの収集まで、RNAの分解を最小限に抑えるために1つのスライドで30分以内に行う必要があります。 5. 運動ニューロンからのRNA調製 収集したニューロンをすべて1匹の動物から解凍し、それらを一緒にプールしてRNAを抽出します。サンプルは、その中の運動ニューロン (Azure B で染色) の数によっては淡い青色に見える場合があります。LMD組織に提供されるプロトコルに従って適切なキットを使用してRNAを抽出し、可能な限り最小体積で溶出する。1 μl を取ってサンプルの量と完全性を確認します。残りのRNAをドライアイスで速凍結し、-80°Cで保存します。 6. RNAの品質と量の決定 メーカーのプロトコルに従って、キャピラリー電気泳動マイクロ流体チップ上の1μlサンプルでRNA品質を決定します。8.5以上のRNAインテグリティ・ナンバー(RIN)を有するRNA製剤の合計は、RNA-seqおよびqRT-PCRに使用することができます。データ出力には、通常、サンプルの近似濃度も含まれます。