Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

Les procédures décrites ici pour l’anesthésie, l’euthanasie, et la perfusion cardiaque des souris ont été exécutées sous un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation d’animal d’université de Yale. 1. Préparation d’instruments et de solutions sans RNase La RNase est un contaminant commun à toutes les surfaces de laboratoire, y compris les paillanes, les micropipettes et l’investigateur. Changez les gants souvent ou régulièrement essuyez avec une solution décontaminante RNAse. Les outils de dissection en acier inoxydable et la verrerie peuvent être rendus sans RNase en chauffant à >200 °C pendant 1 heure ou plus. Remarque: La stérilisation à la vapeur ne détruit pas RNase. Alternativement, essuyez avec une solution décontaminante RNase, puis avec de l’éthanol sans RNase à 70% et séchez à l’air. Essuyez les paillages, les autres surfaces de laboratoire et les micropipettors avec une solution décontaminante de RNase, puis avec de l’éthanol à 70% sans RNase. Désigner un banc de laboratoire ou une zone de travail spécifique pour la récupération et l’analyse de l’ARN. Remarque : Retirez les éjecteurs de pointe avant d’essuyer les arbres des pipettors et laissez-les éteints, si possible. Utilisez des tubes, des tubes à microcentrifugation, des pipettes et des embouts de micropipette certifiés par leur fabricant comme exempts de RNase. L’utilisation de pointes de liaison et de microtubes très bas est recommandée. Si possible, utilisez des boîtes ou des sacs de ces composants fraîchement ouverts et gardez-les séparés de l’approvisionnement général du laboratoire. Obtenir des solutions sans RNase [PBS sans calcium et magnésium (PBS) de Dulbecco, éthanol, éthanol à 70 % sans RNase] de sources commerciales. Utilisez des bouteilles nouvellement ouvertes pour chaque expérience. La source du colorant Azure B est essentielle à la récupération réussie de l’ARN intact. Testez chaque lot de colorant avant de consacrer des échantillons précieux à la coloration et au prélèvement. Recueillir quelques milliers de neurones d’un animal non expérimental, préparer l’ARN, et déterminer l’intégrité de l’ARN comme décrit ci-dessous pour trouver un qui produit constamment des nombres de RIN au-dessus de 8,5. Dissoudre le colorant Azure B (1 %, en poids/vol) dans de l’éthanol à 70 % sans RNase, généralement 0,3 g dans un tube à centrifuger de 50 ml. Bien mélanger sur une bascule à RT pendant la nuit ou jusqu’à ce que toutes les particules se dissolvent. Un tube de cette solution peut être utilisé pour colorer plusieurs lames sans affecter l’intensité de la coloration. Par mesure de précaution, utilisez un tube de coloration différent pour chaque répétition biologique. Utilisez les cryomoldes et o.C.t. pour l’incorporation des sections de cordon sans autre traitement. Maintenir le cryostat à -20 à -24 °C. Après le sectionnement, placer les lames dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’un nombre suffisant ait été préparé. Commencez la préparation de l’ARN dès que possible après la réalisation des lames. Pour l’entreposage à long terme, conserver les blocs de TPO non sectionnés ou partiellement sectionnés, plutôt que les lames, à 80 °C. Fabriquer le tampon de thiocyanate de guanidine pour la préparation de l’ARN à partir des motoneurones disséqués en utilisant les solutions fournies par le fabricant du kit de préparation de l’ARN selon ses instructions. 2. Préparation des sections de moelle épinière de souris (figure 1A) Nettoyez tous les outils de dissection, les lames de verre, les lames de rasoir et la plate-forme de dissection en les faisant cuire ou en essuyant avec une solution décontaminante de RNase, suivie d’éthanol à 70% sans RNase. Laisser sécher pendant 2 min. Gardez tout sans poussière en le recouvrant de lingettes de laboratoire. Les procédures de manipulation des animaux, y compris l’anesthésie, la perfusion cardiaque et l’euthanasie, doivent être effectuées conformément aux exigences du comité institutionnel local de soins et d’utilisation des animaux (IACUC), dans le but d’amener rapidement l’animal au point de dissection de la moelle épinière. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) d’une dose létale de kétamine (450 mg/kg). Une fois qu’un niveau profond d’anesthésie est atteint et confirmé par l’absence d’une réponse pince-orteil, placez la face ventrale de la souris sur une plate-forme de dissection (une planche de polystyrène, par exemple), ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur et insérez l’aiguille papillon de 27 G d’une perfusion dans le ventricule gauche (qui se trouve à la droite de l’investigateur). Nick l’oreillette droite avec une pince pointue, et perfuser avec pbs à un taux de 5-7 ml/min pendant environ 2 min en utilisant une pompe péristaltique. Le liquide qui s’écoule de l’oreillette doit être largement exempt de sang à ce stade. Retirez l’aiguille de perfusion, décapitez la souris et retournez-la sur le tableau de dissection. Ouvrez la peau pour exposer la colonne vertébrale, utilisez de petits ciseaux et une pince pour enlever les vertèbres et soulevez la moelle épinière tout en sectionnant les racines nerveuses avec une pince tranchante. La vitesse et la pratique sont essentielles pour passer du début de la perfusion à l’ablation du cordon; cela ne devrait pas prendre plus de 7 min. Rincez le cordon pendant 10 secondes dans de l’eau sans RNase pour laver tout sang résiduel. Posez la moelle épinière sur une lame de verre sans RNase avec une pince incurvée très doucement mais rapidement. Divisez la moelle épinière transversalement à l’aide d’une lame de rasoir propre en 9-10 morceaux. Placez les pièces dans un cryomold rempli d’O.C.T. en utilisant les mêmes pinces et alignez-les verticalement à l’aide d’une aiguille propre. Placez le moule dans un plateau peu profond contenant du 2-méthylbutane pré-refroidi avec de l’azote liquide, puis mettez le plateau dans un bain d’azote liquide pour congeler rapidement les morceaux de moelle épinière afin d’éviter la dégradation de l’ARN. Conservez le bloc intégré à l’OPO à -80 °C jusqu’à 6 mois avant le sectionnement. Le processus de récupération du cordon à la congélation doit être effectué dans les 5 minutes pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Cryosection du bloc incorporé en O.C.T. à -20 °C avec un cryostat pour produire des tranches de 20 μm, chacune contenant 9 à 10 sections transversales de la moelle épinière, sur des lames PEN-membrane 2 μm sans RNase conservées initialement à température ambiante pour s’assurer que les sections adhèrent à la lame. Recongelez immédiatement la section sur une surface de -20 °C à l’intérieur du cryostat. Conservez les diapositives à -80 °C jusqu’à ce qu’elles le dent. 3. Coloration des sections de la moelle épinière (figure 1A) Sur un rack propre, disposez six tubes coniques de 50 ml. Remplissez-les tous avec 25-30 ml d’éthanol à 70% sans RNase, de sorte que la profondeur soit suffisante pour couvrir toutes les sections d’une lame lorsque la lame est immergée. Fabriquez 30 à 35 ml de solution Azure B à 1 % comme décrit précédemment et conservez-la sur le même rack pour réduire le temps entre les solutions de changement pendant le lavage ou la coloration. Gardez trois ou quatre lingettes de laboratoire devant le rack pour vider rapidement la solution supplémentaire. Sortez les toboggans du congélateur à -80 °C sur de la glace carbonique. Décongelez une lame en la plaçant sur une paume gantée. Enlevez la majeure partie de l’humidité et de la condensation sur la lame en l’essuyant avec une lingette de laboratoire, en prenant soin de ne pas toucher les sections. Mettez la lame sur du dessicant de gel de silice frais dans une boîte de Pétri pendant 30-40 secondes pour sécher complètement. Si l’humidité du laboratoire est élevée, un bref traitement dans un dessicateur sous vide peut être utilisé pour sécher la lame plus rapidement. Lavage et coloration. Trempez la lame séchée dans le premier tube d’éthanol à 70% sans RNase. Trempez la lame pendant 30 secondes, puis lavez la lame pour retirer l’OCT en la trempant de haut en bas pendant 45-60 secondes. Sortez la lame de la solution et égouttez l’excès de liquide sur des lingettes de laboratoire. Répétez le même processus en trempant la lame dans le deuxième tube d’éthanol à 70%. Si le PTOM autour des sections de la moelle épinière n’a pas complètement disparu, répétez le lavage dans le troisième tube. Après avoir drainé l’excès de liquide, plongez la lame dans une solution Azure B à 1% dans de l’éthanol sans RNase à 70% pendant 30-45 sec. Drainez l’excès d’Azure B sur une lingette de laboratoire ; à ce stade, toute la diapositive sera bleue. Plongez la lame dans le tube suivant d’éthanol à 70%, et plongez de haut en bas rapidement 3-4x pour éliminer l’excès de colorant et rendre visible la coloration spécifique du motoneurone. Si les sections semblent très sombrement colorées, répétez l’étape de destaining dans un tube frais d’éthanol à 70%. Si la coloration semble trop légère, retournez la diapositive à la solution Azure B pendant encore 30 secondes et répétez la décoloration. Essuyez l’excès d’éthanol et séchez la lame à l’air pendant environ 40 secondes jusqu’à ce que tout le liquide ait disparu. La matière grise sera bleu clair, tandis que les motoneurones seront colorés d’un bleu profond, ce qui est facilement visible. Commencez la dissection immédiatement. 4. Microdissection par capture laser (LMD) (Figure 1B) Allumez le microscope et déchargez le support du tube pour fixer le capuchon d’un tube de microfuges de 0,6 ml pour le prélèvement d’échantillons. Mettre 30 μl de tampon de lyse de thiocyanate de guanidine dans le capuchon d’un tube de microfuge de 0,6 ml. Couvrir la surface du bouchon avec du liquide en étalant la solution à l’aide d’une pointe de pipette. De cette façon, tous les neurones collectés seront dissous dans une solution solubilisante au fur et à mesure qu’ils seront disséqués. Alignez le capuchon avec le trou et l’objectif avec le logiciel de microscope. Gardez le capuchon dans la position couverte jusqu’à ce que vous commenciez la capture laser. Placez la lame séchée à l’air sur la scène du microscope LMD à l’envers, de sorte que la membrane de la lame PEN soit exposée vers le bas. La membrane avec des sections doit faire face au trou, sous lequel se trouve le tube de collecte. Allumez le laser 10 min avant de commencer la préparation de la diapositive. Concentrez-vous sur une section de moelle épinière avec l’objectif 5X. Passer à l’objectif 20X pour la dissection. Marquez une région « factice » avec le stylo lumineux et laissez le laser la découper sans la collecter. Cela détend la membrane PEN et permet de marquer et de couper plusieurs régions successivement. Recentrez et identifiez les motoneurones dans la région ventrale de klaxon. Ces neurones sont reconnaissables à leur emplacement, leur morphologie pyramidale, leur grande taille et leur coloration bleu foncé avec Azure B (Figure 2). À l’aide du stylo lumineux, sélectionnez l’outil de dessin et marquez le long du bord des motoneurones, en faisant un contour complet. Essayez de rendre le contour aussi proche que possible du motoneurone pour éviter la contamination par des cellules autres que le motoneurone. (Testez certaines sections au préalable pour voir quelle est la largeur de la ligne de découpe laser et ajustez le jeu si nécessaire.) Marquer plusieurs cellules avant de couper; le logiciel se souviendra des positions. Placez le capuchon sous la position de coupe en cliquant sur la position du capuchon. Cliquez sur le bouton démarrer pour lancer la dissection des motoneurones avec le laser. Recueillir tous les motoneurones de toutes les sections sur une diapositive dans le capuchon d’un tube de microfuge. Une fois la collecte terminée, sortez le tube de microfuge du support en déchargeant le plateau et en délogeant doucement le tube. Dissoudre complètement les motoneurones dans le tampon en pipetting la solution de haut en bas. Déplacer la solution dans le corps du tube en centrifugant à 14 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Congeler immédiatement l’échantillon dans de la glace carbonique et le conserver à -80 °C. Ce processus, de la coloration de la lame à la collecte des motoneurones, doit être effectué dans les 30 minutes pour une lame afin de minimiser la dégradation de l’ARN. 5. Préparation de l’ARN à partir de motoneurones Décongelez tous les neurones collectés d’un animal et regroupez-les pour extraire l’ARN. Les échantillons peuvent sembler bleu pâle en fonction du nombre de motoneurones (tachés d’Azur B) qu’ils contiennent. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit approprié selon le protocole prévu pour le tissu LMD, en éluant dans le volume minimum possible. Prélever 1 μl pour vérifier la quantité et l’intégrité de l’échantillon. Congeler rapidement l’ARN restant sur de la glace carbonique et le conserver à -80 °C. 6. Détermination de la qualité et de la quantité de l’ARN Déterminer la qualité de l’ARN avec l’échantillon de 1 μl sur une puce microfluidique d’électrophorèse capillaire selon le protocole du fabricant. Les préparations d’ARN total avec un numéro d’intégrité de l’ARN (NRI) supérieur à 8,5 peuvent être utilisées pour l’ARN-seq et la qRT-PCR. La sortie des données comprend également généralement la concentration approximative de l’échantillon.