Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection
Özet
Hoogwaardige totale RNA is bereid uit cellichamen van muis ruggenmerg motorneuronen door laser capture microdissection na het kleuren van ruggenmerg secties met Azure B in 70% ethanol. Voldoende RNA (~40-60 ng) wordt teruggewonnen uit 3.000-4.000 motorneuronen om downstream RNA-analyse door RNA-seq en qRT-PCR mogelijk te maken.
Abstract
De bereiding van hoogwaardig RNA uit cellen van belang is van cruciaal belang voor een nauwkeurige en zinvolle analyse van transcriptieverschillen tussen celtypen of tussen hetzelfde celtype in gezondheid en ziekte of na farmacologische behandelingen. In het ruggenmerg wordt een dergelijk preparaat van motorneuronen, het doelwit van interesse in veel neurologische en neurodegeneratieve ziekten, gecompliceerd door het feit dat motorneuronen <10% van de totale celpopulatie vertegenwoordigen. Laser capture microdissection (LMD) is ontwikkeld om dit probleem aan te pakken. Hier beschrijven we een protocol om het ruggenmerg van de muis snel te herstellen, te bevriezen en door te stoten om RNA-schade door endogene en exogene RNases te voorkomen, gevolgd door kleuring met Azure B in 70% ethanol om de motorneuronen te identificeren terwijl endogene RNase wordt geremd. LMD wordt vervolgens gebruikt om de bevlekte neuronen rechtstreeks in de guanidine thiocyanaatlysebuffer vast te leggen, waardoor de RNA-integriteit behouden blijft. Standaardtechnieken worden gebruikt om het totale RNA terug te winnen en de integriteit ervan te meten. Dit materiaal kan vervolgens worden gebruikt voor downstream analyse van de transcripties door RNA-seq en qRT-PCR.
Introduction
In zoogdierweefsels die uit meerdere verschillende celtypen bestaan, heeft de komst van laser capture microdissection (LMD) instrumentatie de mogelijkheid geboden om een specifiek celtype te selecteren voor analyse op RNA- of eiwitniveau. Op dit moment maken versterkings- en next-gen sequencingtechnieken het gebruik van een pool van totaal RNA uit een paar duizend cellen mogelijk om een relatief grondige inventaris van het transcriptoom te verkrijgen, inclusief beoordeling van relatieve niveaus van RNA’s en identificatie van verschillende gesplitste vormen. Tot op heden zullen proteomics-analyses van een paar duizend cellen door alleen meer overvloedige soorten reiken. We hebben bijvoorbeeld < 1.000 van de meest voorkomende eiwitten uit 3.000-4.000 motorneuroncellichamen geïdentificeerd (niet weergegeven), en Zhu en collega's hebben onlangs gemeld dat ze 2.665 eiwitten uit ~ 15.000 tumorcellen hebben geïdentificeerd1. Met verdere ontwikkelingen van massaspectrometrie is het echter waarschijnlijk dat dergelijke analyses zich tot veel grotere diepte zullen uitstrekken.
Hier presenteren we een specifiek protocol dat wordt gebruikt voor LMD van motorneuroncellichamen uit het ruggenmerg van muizen, gevolgd door de voorbereiding van RNA. Dit protocol werd gebruikt in de context van het vergelijken van RNA’s van motorneuronen van presymptomatische transgene mutante superoxide dismutase (SOD)1 amyotrofische laterale sclerose (ALS) muizen met RNA’s bereid uit een wilde SOD1 transgene stam door zowel RNA-seq als qRT-PCR validatie2. Met name motorneuronen, in de voorste hoorn van de grijze stof in het ruggenmerg, vormen <10% van de totale celpopulatie, omgeven door een zee van astrocyten, en als zodanig kan hun transcriptieprofiel niet gemakkelijk worden gedeconsequenteerd uit studies van het hele koord. Een laser capture-benadering is dus ideaal voor het analyseren van RNA-expressie in deze cellen, waarbij de fysiologie wordt bewaard door het snoer snel te exciseren en te bevriezen na een korte intracardiale zoutoplossingperfusie. Motorneuron somata zijn groot en zijn dus gemakkelijk detecteerbaar, hier met behulp van een kleurstof die een sterke affiniteit heeft voor neuronen3. Bovendien leveren deze cellen met een dergelijke grootte een relatief grote hoeveelheid RNA per gevangen cel. De gebruikte procedure, zoals hieronder beschreven, kan gemakkelijk worden aangepast om andere neuronale celtypen te verkrijgen, evenals mogelijk andere celtypen, die specifiek worden geïdentificeerd door kleuringstechnieken of door antilichaamkleuring.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste graadmeter voor het succes van dit protocol voor de productie van totaal RNA door lasermicrodsectie van dwarslaesiesegmenten is de RIN-waarde5. Voor RNA-monsters van hogere eukaryoten leveren waarden boven 8,5 regelmatig sequencing- en qRT-PCR-gegevens van hoge kwaliteit op. Als de opbrengst laag is, maar de kwaliteit hoog, herhaal dan het preparaat. Als de integriteit echter lager is (zelfs 7,5-8), is het beter om de bron van het probleem te vinden en het opnieuw te proberen. Er zijn veel stappen waarbij er iets mis kan gaan, maar eigenlijk slechts twee bronnen van het probleem – endogene RNase-besmetting of exogene RNase-besmetting. De eerste kan door de praktijk worden aangepakt, zodat de tijd van het offeren van de muis tot het bevriezen van het O.C.T-ingebedde snoer wordt geminimaliseerd. Het andere punt in het protocol waar endogene RNase kan bijdragen aan een slecht resultaat is tijdens de bereiding van de plakjes. Elk plakje moet zich snel aan een PEN-schuif op kamertemperatuur hechten, maar deze smelt (de O.C.T wordt duidelijk). Hoe sneller het plakje kan worden gerevrozen, hoe beter. De cryostaat die we gebruiken heeft vlakke oppervlakken in de kamer die op -20 °C staan, die we gebruiken om de plak snel opnieuw in te vriezen. Zoek een vergelijkbare plek in de gebruikte cryostaat en zorg ervoor dat het plakje snel weer ondoorzichtig wordt.
Het opsporen van bronnen van exogene RNase kan moeilijk zijn, omdat er zoveel mogelijkheden zijn. De enige reagentia die niet uitdrukkelijk RNase-vrij zijn, zijn O.C.T. en de Azure B. Als de Azure B eerder naar tevredenheid heeft gepresteerd, probeert u een nieuwe fles O.C.T., hoewel dit reagens nooit een probleem is geweest. RNase-vrije reagentia kunnen ook worden vervangen, zelfs van een andere leverancier. Een veel waarschijnlijker bron is de onderzoeker. Naast een grondige opruiming van het werkgebied, is het vaak handig om een ander laboratoriumlid langs te laten komen en alle stappen in de procedure te observeren. Zelfs als dit iemand is die deze procedure niet routinematig uitvoert, kan een nieuwe reeks ogen een anders onopgemerkte bron van besmetting oppikken.
Om dit protocol uit te breiden tot het herstellen van RNA uit andere ruggenmergcellen, uit ruggenmergcellen van andere soorten of van specifieke celtypen in andere organen, moeten op verschillende gebieden worden gewijzigd om een duidelijke identificatie van de cellen van belang te bereiken en tegelijkertijd de impact van endogene RNase te verminderen of op zijn minst te minimaliseren. In het protocol hier, snelle verwijdering en bevriezing van het snoer, in combinatie met Azure B-kleuring in 70% ethanol, maakte zowel minimalisatie van RNA-afbraak als eenvoudige identificatie van motorneuroncellichamen mogelijk. Azure B is een gevestigde histochemische vlek voor neuronen die lijkt te binden aan RNA3 en is gebruikt om RNA-gehalte van neuronen te evalueren in autopsiemonsters van hersenweefsel van patiënten met neurodegeneratieve ziekte6. Azure B-kleuring heeft met name geen invloed op de integriteit van het gezuiverde RNA of op het vermogen om omgekeerd te worden getranscribeerd en geanalyseerd. Andere kleurstoffen, zoals cresylviooltje7 en toluidineblauw8, zijn gebruikt in vergelijkbare LMD-protocollen. Het verzamelen van de cellichamen rechtstreeks in guanidine thiocyanaat oplossing als ze werden ontleed, vormde de laatste stap die resulteerde in het routinematige herstel van intact RNA.
Vergelijkbare benaderingen kunnen worden voorgesteld voor andere cellen en organen, erkennend dat het identificeren van de cellen van belang terwijl RNA-afbraak door endogene RNases wordt geminimaliseerd of, bij voorkeur, wordt voorkomen, de essentiële vereiste is voor een succesvolle analyse. In weefsels met hoge niveaus van RNase, zoals alvleesklier, zijn snelle behandeling en lage temperatuur gecombineerd om herstel van RNA uit β-cellen mogelijk te maken, profiterend van hun natuurlijke autofluorescentie voor visualisatie9. Procedures met antilichaamkleuring voor identificatie zijn ook gemeld10, maar zijn niet volledig succesvol geweest in onze handen. Ten slotte zijn er veel muismodellen beschikbaar die fluorescerende fusie-eiwitten(d.w.z. GFP, YFP, RFP) uitdrukken in cellen van belang, die kunnen worden gebruikt om ze te identificeren in weefselsecties op de LMD-microscoop. In feite drukken de muisstammen die we met dit protocol hebben geanalyseerd een fusie-eiwit uit tussen SOD1 en YFP11, en hun spinale motorneuronen zijn zeer fluorescerend. We waren echter niet in staat om een reeks ethanolwassingen en / of uitdrogingsomstandigheden te vinden die tegelijkertijd de O.C.T. zouden verwijderen, de RNase-activiteit zouden remmen en consequent voldoende YFP-fluorescentie zouden handhaven om visualisatie van de motorneuronen en hun herstel door LMD mogelijk te maken. Misschien kan een nieuw fluorescerend eiwit of een variant van de beschikbare die fluorescentie in organische oplosmiddelen handhaaft, worden gevonden om deze beperking te overwinnen.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen George Farr en leden van het Horwich lab bedanken voor de nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
Referanslar
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse.. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick’s and Alzheimer’s diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
