Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.
A fim de demonstrar a localização da superfície da célula de um receptor transmembranar putativo em neurónios em cultura, que marcado a proteína na superfície dos neurónios vivos com um anticorpo primário específico criado contra uma porção extracelular da proteína. Dado que os receptores são de tráfico de e para a superfície, se as células são permeabilizadas após a fixação, em seguida, tanto na superfície celular e da proteína interna irá ser detectada pelo mesmo anticorpo secundário marcado. Aqui, nós adaptamos um método utilizado para estudar o tráfico de proteína ("alimentação anticorpo") para a proteína diferencialmente etiqueta que tinham sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpo e proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período . A capacidade de distinguir estas duas piscinas de proteína tornou-se possível através da incorporação de um passo de bloqueio durante a noite com anticorpo secundário sem rótulo altamente concentrada após um incubatio inicialn de neurónios unpermeabilized com um anticorpo secundário marcado por fluorescência-. Após o bloqueio de fase, a permeabilização dos neurónios permitiram a detecção da piscina internalizado com um anticorpo secundário fluorescente marcada com um fluoróforo diferente. Usando esta técnica nós fomos capazes de obter informações importantes sobre a localização subcelular deste receptor putativo, revelando que ele era, de fato, traficadas para a superfície celular em neurônios a. Esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células e proteínas da superfície celular, proporcionando um anticorpo adequado para um epitopo extracelular está disponível.
Ao estabelecer a função das proteínas recém-identificadas, a investigação da localização subcelular e do tráfico da proteína em questão pode fornecer pistas importantes sobre o provável papel / s de 1,2 proteína. Análise bioinformática do transcriptoma do neocórtex desenvolver 3 nos forneceu uma lista de genes que apresentam expressão alterada durante rato corticogenesis cérebro. Em seguida, adoptou uma abordagem gene knockout para determinar que a proteína codificada por um destes genes, sez6, tem um papel chave no desenvolvimento neuronal. Observou-se que o gene relacionado com Apreensão 6, ou Sez6, proteína está localizado em dendritos em desenvolvimento e também está presente nas espinhas dendriticas, as estruturas especializadas em dendritos que recebem e integram sinais excitatórios. Além disso, quando esta proteína está ausente, os dendritos e sinapses excitatórias falhar para formar correctamente 4. A isoforma dominante provável da proteína tem características de um transmembrane do receptor embora, quando a distribuição sub-celular da proteína immunolabeled foi examinada por microscopia confocal ou por microscopia imunoelectrónica a maioria, se não a totalidade, do sinal apareceram associadas a pequenas vesículas no compartimento somatodendrítico com pouco, ou nenhum, proteína marcada na membrana plasmática na superfície da célula.
A fim de demonstrar definitivamente que este receptor putativo com um grande domínio extracelular predito é de tráfico para a membrana plasmática, que adoptou uma abordagem em células vivas, utilizando o anti-soro que havia gerado a uma porção extracelular da proteína para identificar a proteína na superfície da célula. Ao combinar esta abordagem "alimentação anticorpo", com duas aplicações de anticorpo secundário marcado diferencialmente separados por um passo de bloqueio grande e um passo de permeabilização, fomos capazes de identificar dois conjuntos diferentes de proteínas que se distinguem por ligação a anticorpos secundários marcados fluorescentemente rolamento fluores diferenteetiquetas rentes. Assim, nós fomos capazes de distinguir a proteína que tinha sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpos a partir de proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período. Usando este método, foi estabelecido que a proteína de interesse é de tráfico de e para a superfície da célula em neurónios. Portanto, essa técnica relativamente rápido e simples mostrou-se mais informativo do que os métodos tradicionais ou imunocitoquímica microscopia eletrônica de imuno pré-incorporação, apesar do fato de que usamos o mesmo anti-soro policlonal de coelho para todas estas técnicas. Esta técnica é geralmente aplicável a qualquer proteína transmembranar prevista uma boa anticorpo que reconhece os epítopos de domínio extracelular é acessível. A técnica tem sido utilizada anteriormente para estudar o tráfico do receptor do receptor de glutamato GluR1 subunidade 5.
A técnica aqui descrita é complementar à da biotinilação da superfície celular (revisto por Arancibia-CARCAMO et al.) 12 e é o método de escolha para preservar a informação sobre a localização subcelular da proteína internalizado, proporcionado um anticorpo primário adequado para uma epitopo extracelular está disponível. Em adição, a quantificação de proteína tráfico / internalização ao longo do tempo pode ser realizada (por lamelas, que fixa em diferentes momentos ao longo da…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Teele Palumaa para a assistência com os números. Financiado pelo Projeto Grant 1008046 do National Health and Medical Research Council, na Austrália.
PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |