תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים
Özet
אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.
Abstract
על מנת להדגים את הלוקליזציה של הקולטן הטרנסממברני המשוערת בנוירונים בתרבית על פני קרום התא, שכינינו את החלבון על פני השטח של תאי עצב חיים עם נוגדן ראשוני ספציפי שהועלה נגד חלק תאי של החלבון. בהתחשב בכך שקולטנים נסחרים ולמפני השטח, אם תאי permeabilized לאחר קיבוע אז גם על פני קרום התא והחלבון פנימי יזוהו על ידי אותו נוגדנים משני שכותרתו. כאן, אנו מותאמים שיטה המשמשת ללימודי סחר בחלבון ("האכלת נוגדן") לדיפרנציאלי חלבון תווית שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדנים והחלבונים שגם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו . היכולת להבחין בין שתי בריכות של חלבון אלה התאפשרה באמצעות השילוב של צעד חסימת לילה עם נוגדנים משני ללא תווית מרוכזת מאוד לאחר אינקובטורים ראשונייםn של נוירונים unpermeabilized עם נוגדנים משני fluorescently שכותרתו. לאחר חסימת הצעד, permeabilization של נוירונים אפשרו זיהוי של הבריכה הפנימה עם נוגדנים משני ניאון שכותרתו עם fluorophore שונה. השימוש בטכניקה זו היינו יכול לקבל מידע חשוב על מיקום subcellular של קולטן המשוערת זו, חושף כי זה היה, אכן, נסחרים לעל פני קרום התא בתאי עצב. טכניקה זו היא החלים רחבה למגוון של סוגי תאים וחלבונים על פני קרום התא, מתן נוגדן מתאים לאנטיגן תאי הוא זמין.
Introduction
בהקמת הפונקציה של חלבונים שזוהו לאחרונה, חקירה של הלוקליזציה וסחר subcellular של החלבון מדובר יכולה לספק רמזים חשובים על התפקיד / ים הסביר של 1,2 החלבון. ניתוח bioinformatic של transcriptome של הניאוקורטקס פיתוח 3 סיפק לנו רשימה של גנים תערוכת ביטוי השתנה במהלך corticogenesis מוח עכבר. לאחר מכן, אנו אימצנו גישת נוקאאוט הגנטי כדי לוודא שהחלבון מקודד על ידי אחד מהגנים האלה, sez6, יש לו תפקיד מפתח בהתפתחות תאי עצב. אנו הבחנו כי הגן הקשור לתפיסה 6, או Sez6, החלבון ממוקם בדנדריטים פיתוח ונוכח גם בקוצים הדנדריטים, מבנים מיוחדים על דנדריטים שיקבלו ולשלב אותות מעוררים. יתר על כן, כאשר חלבון זה הוא חסר, דנדריטים וסינפסות המעוררות לא מצליחים ליצור בצורה נכונה 4. יש איזופורם הדומיננטי הסביר של חלבון תכונות של transmembranקולט דואר אם כי, כאשר חלוקת subcellular של חלבון immunolabeled נבדקה על ידי מיקרוסקופיה confocal או על ידי מיקרוסקופ immunoelectron רוב, אם לא כולם, של האות הופיעה קשור עם שלפוחיות קטנות בתא somatodendritic עם מעט, או לא, חלבון הנקרא על קרום הפלזמה על פני התא.
כדי להראות בודאות כי קולטן המשוערת זה עם תחום תאי גדול ניבא הוא נסחר קרום הפלזמה, אימצנו גישה לחיות תאים באמצעות נסיוב היינו נוצר לחלק החוץ תאי של החלבון לתייג חלבון על פני שטח התא. על ידי שילוב של גישה זו "נוגדני האכלה" עם שני יישומים של נוגדנים משני באופן דיפרנציאלי שכותרתו מופרדים על ידי צעד חסימה נרחב וצעד permeabilization, היינו יכול לזהות שתי בריכות שונות של חלבון מכובד על ידי קשירה לנוגדנים משני fluorescently שכותרתו נושאים fluoresc שונהתגיות אף אוזן גרון. לפיכך, היינו יכול להבחין חלבון שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדן מחלבון כי גם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו. באמצעות שיטה זו, הקמנו שהחלבון של עניין הוא נסחר ומתא השטח בתאי עצב. לכן, טכניקה יחסית מהירה ופשוט זה הוכיחה יותר אינפורמטיבי יותר מאשר שיטות immunocytochemistry מסורתיות או במיקרוסקופ אלקטרונים immunogold מראש הטבעה, למרות שהשתמשנו באותו נסיוב הארנב polyclonal לכל הטכניקות הללו. טכניקה זו היא בדרך כלל החלה על כל חלבון הטרנסממברני סיפקה נוגדן טוב להכיר אפיטופים תחום תאיים הוא זמין. הטכניקה הייתה בשימוש בעבר כדי ללמוד סחר בקולטן של למקטע GluR1 קולטן הגלוטמט 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה המתוארת כאן היא משלימה לזו של biotinylation על פני קרום התא (נסקר על ידי Arancibia-Càrcamo et al.) 12 וזה שיטת בחירה של שמירת מידע על לוקליזציה subcellular של החלבון הפנים, ובלבד נוגדן ראשוני מתאים ל epitope תאי הוא זמין. בנוסף, לכמת את סחר חלבון / הפנמה לאורך זמן יכול להתבצע (על …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Teele Palumaa לסיוע עם הדמויות. פרויקט ממומן על ידי מענק מ1008046 הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית, אוסטרליה.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
Referanslar
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
