カニ手足の固有感覚と緊張受容体：学生実験室の練習

1。 Propodite – 指節（PD）の神経から切開および録音の電気的活動後ろから甲全体にカニを保持し、爪を避けて、ピンセットで長節の近位部を挟ま。足は死に出血から動物を防ぐために自分の体の一部を切るでしょう。青カニを扱うときは、むしろ積極的かつ非常に高速であるように、十分に注意してください。 図1まず、カニの足を歩く 。弦音器官（斜線領域）の解剖学的位置は、この回路図に重ねられる。両矢印の頭のPDの神経実験用の脚を横断する場所を示しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 propoditeとcarpodite間のカットを行います。腕節とtを捨てる彼は長節（ 図1）を添付。 ＃11のブレード（ 図2および3）とメスでpropoditeの色素沈着（横）側にクチクラに大きな窓をカット（注）。深くカットしないでください。 下のメスの刃をスライドさせてキューティクル層を除去し、キューティクルに平行である。これはキューティクルに付着した筋線維を切断する。 無傷で、色素の上propoditeの（内側）側を小さいウィンドウをカットするが、顆を残し、同じ技術を使用して（ソケットジョイントまたはセグメント間のヒンジ）付属。 図2。propodite上の点線に沿って切り取ります。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 N "SRC =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "幅=" 500px "/> 図3。（矢印は神経束をアウトライン）]ウィンドウに神経を露出 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 ダウンの準備をピンカニ生理食塩水を含有するシルガードが並ぶお料理を準備します（注）。種特異的食塩水のレシピについては、表1を参照してください。 慎重にファイアーポリッシュガラス針を用いて探索することによって、PDの臓器の位置を確認します。関節にまたがる弾性ストランドは、銀外観を有している。 腱の両側から臓器の表示をあいまいに筋線維を削除します。 PD器官またはその神経を傷つけないよう十分注意してください。 これが達成されたら、しっかりと（ 図4）を上に向け顔料側（横方向）と皿に製剤を再。 <img alt="図4" fo:content-width= "5インチ" src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig4.jpg"幅= "500px" /> 図4。のPD臓器や神経を露呈した 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 FREE-UPに神経の長さが長い（1.5 cm）の記録のために順に限り近位にできるだけpropodite内のPD器官の神経に従ってください。 PDの神経が、まだ主脚の神経に接続されている間これが最善に行われます。 ガラス針を用いて主脚の神経からのPDの神経を分離した後、アイリスはさみで近位に、PDの神経を切断注：解剖の際にストレッチや神経を引っ張らないでください。 拡張された、完全に屈曲した位置に指節を移動します。極端な屈曲伸展位置がどこにあるかに関するメモを取り、後で使用するために中間点。 生理食塩水浴の中にアース線を配置します。 Eの電源を入れますlectrophysiology記録ハードウェア/ソフトウェア（注）当社のセットアップは、以前に23に記載されている。 それは顕微鏡のステージを見下ろすされるように顕微鏡を配置します。予備校ディッシュがステージ上に置かれたら、あなたは最高の準備を可視化するために高強度の照明光の位置を調整する必要があります。 付属の吸引電極接合体は生理食塩水浴と準備への容易なアクセスを持つようにマイクロマニピュレータを配置します。オンラインビデオ24に示すように、吸引電極が構成されている。 神経活動を検出するために、吸引電極へのPDの神経の切断端を描画します。 ガラスプローブまたは木製のダボを用いて数サイクルの拡張や屈曲した位置全体に強弱弱格を移動します。 強弱弱格は、延長曲げられ、半ば位置に固定されたときに次のアクティビティを観察します。 2。緊張から電気的活動を記録する神経フォース世代を監視しながら、 脚の外側および内側側を決定します。内側には、指の爪で長節領域でそっとつまんで感じることができるソフトな風合いを持っています。 皿にこのソフトキューティクル側を上にして置きます。オープナーの筋肉を神経支配刺激神経の運動神経も腕節におけるストレッチャ筋肉を神経支配。 オープナーの筋肉を刺激するためにcarpodite領域のストレッチャー運動神経を単離し、吸引電極を用いて刺激した。脚部の近位部​​分はハサミで長節を横切開することによって除去される。 内側の手根領域でキューティクルのセクションを削除（内側、 図5A）。 ベンダー筋の内突起を切り取り、足キャビティから主脚神経を引っ張らないように慎重に筋肉を取り外します（ 図5B、Cは内突起が分離されているベンダーには、矢印を注意してください）。主脚の神経とブラジャーストレッチャ心筋へNCH次いで、（ 図5D）を観察することができる。 ストレッチャ筋肉（矢印で図5E）にメイン神経束から分岐する神経を見つける。これは近くの筋肉に切断し、刺激するように吸引電極に引き込むことができます（ 図5FとGを、矢印は分岐を示している）。 神経をつまむことなく、開幕戦に向けて投射する神経の部分を引き出す。ストレッチャ/オープナー運動神経を横断する。 吸引電極に運動神経を引いて、それを刺激する。 オープナーの筋肉とテンション神経を露出することは近い筋肉やpropoditeの腹側領域を除去。 propodite中＃11のブレード（ 図6）と、メスとの緊密な筋肉を切断注：それはオープナー運動神経を損傷する可能性があるため、近位領域に深くカットしないでください。 <img alt="図5" fo:content-width = "5インチ" src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig5.jpg"幅= "500px" /> 図5。オープナーの筋肉を刺激するための運動ニューロンを露出させるための解剖手順 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 図6。それは取り外すことができますので、近い筋肉を露出させpropoditeの腹側半分にキューティクルを切った 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 生きている神経細胞を維持するために解剖プロセス全体を通して、新鮮な冷却生理食塩水で食塩水を交換する。さらに解剖については、解剖顕微鏡下で準備ディッシュを配置し、光ファイバ照明を使用しています。 慎重に、その添付ファイルから近い腱を切る先鋭中規模のはさみを使って強弱弱格。 はっきりと見えるはずです主脚神経からオープナーの筋肉への分岐を乱さないように注意してください。 近い筋肉や腱を取り外し、廃棄します。 解剖ピンと強弱弱格に穴を作る。この穴はテンション（力）トランスデューサに金属ピンをフックするために後で使用しますが、それは手順のこの段階でそれを作ることが必要である。 オープナー筋の遠位領域におけるオープナーの筋肉と内突起に突出神経枝の位置を確認します。慎重にファイアーポリッシュガラスツールで神経を探る。 運動神経束に内突起や収益の先端部から生じる張力神経を観察します。 、神経活動を検知カニ生理食塩水を吸引電極を記入し、電極中にオープナーテンション神経の切断端を描画します。吸引電極が神経にしっかりとフィットしていることを確認してください。 neuraのために調べるオープナー内突起上の受動的な緊張のL相関する。テンション神経からの電気的活動を記録しながら、（ すなわちオープナーの筋肉を伸ばす）、拡張関節内に急速に強弱弱格を回転させる。 次に、刺激周波数の関係で積極的な力の開発をテストします。 フックの先端が強弱弱格に小さな穴を通過するように、しっかりと金属フックを取り付けます。 力変換器に金属フックのもう一方の端を接続します（注）。ピンは発生力の最大を検出するための変換器に垂直になるようにするたびに、変換器は、90°の角度であることを確認します。 それは開幕戦の関節の約45°の角度になるようにフックと強弱弱格を引っ張る。 今250ミリ秒、100 Hzで運動神経を刺激し、力だけでなく、テンション神経の発火頻度を測定します。 オープナーの筋肉繊維が弛緩しているように、完全に延びた位置にジョイントを配置します。 S250ミリ、100 Hzで運動神経をtimulate力だけでなく、テンション神経の発火頻度を測定します。 それが（〜90°）に完全に曲げられるようにベンド/ジョイントを曲げる。この位置でオープナーの筋肉繊維が完全に引き伸ばされます。筋肉のこの受動的なストレッチのために変換器によって測定されたいくつかの力があるかもしれません。 250ミリ秒のための100Hzで運動神経を刺激し、力だけでなく、テンション神経の発火頻度を測定します。 力を測定した後、様々な周波数の一連の手順に従います。各関節の位置に8月10日秒20、40、60、80、および100 Hzのを。 迅速なテンションリリースと応答を測定します。力変換器のフックは簡単に強弱​​弱格の穴から押し出すことができるように準備を手配。 それが（〜90°）に完全に曲げられるようにベンド/ジョイントを曲げる。今5秒の連続刺激と100Hzで運動神経を刺激する。 最初のseconの後にテンションがオープナーの筋肉に蓄積しているようにD以下、強弱弱格にある穴からピンを押してください。 強弱弱格を保持しているピンのリリース前と後のテンション神経記録を調べてください。 張力ニューロンの出力を変化させるようなオクトパミン、セロトニン、およびproctolinなどの神経活性物質の調節効果は、露出オープナーの筋肉の上に入浴メディアにこれらの分子を添加し、実験を繰り返すことにより決定することができる。 ピペットを使用して、準備を介して1〜2ミリリットルを滴下する。 3。美脚ウォーキング甲殻類における染色末梢神経系の構造 メチレンブルー技術 蒸留水の二つの部分に1パートメチレンブルークロリドストック溶液（0.25％）を希釈します。 緩衝生理食塩水の5つの部分に、この混合物を追加します。徹底的に関心のある領域を灌漑。 セクション1のプロトコルに従って足を解剖。プレインキュベート12月13日℃のメチレンブルー溶液中paration 染色の進行を追跡するために低強度の照明を使用して解剖顕微鏡で準備ごとに10〜15分を調べます。染色は他では、時間内に完了されるいくつかのケースでは、一晩中かかる場合があります。 4 -ジ-2 – ASP法 蛍光色素は、バック充填PDニューロンを直接浴から製剤を染色するために使用することができる。しかし蛍光染色を表示する能力を持つ、適切な顕微鏡が必要となります。 セクション1のプロトコルに従って足を解剖。 4 – ジ-2-ASPソリューション10μMの濃度の準備をインキュベートし、15分間冷蔵庫に準備しておきます。準備をカバーするだけの十分な解決策を使用してください。 すぐに準備を撮影し、水銀灯への暴露の上は避けてください。この蛍光色素は比較的早く消え。 <li> 塩化コバルト法 セクション1のプロトコルに係るPD神経を露出し、冷生理食塩水に浸漬保管してください。 のCoCl 2を保持するためにワセリンをよく作る。どんなのCoCl 2が食塩浴にこぼれた場合は、製剤全体が黒く染色し、準備が廃棄されるべきである。 、ポリスチレンシートの小さなカットをスリッププラスチックプラットフォームを作るために、それが離れて浮遊するか（ 図7）生理食塩水浴中に浸漬にならないようにそれを固定する。 図7。皿に所定の位置に保持するためのピンを有するポリスチレンシート 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 使い捨て注射器に固定細い皮下注射針からワセリンを取り出し、その後、神経はポリスチレンのスリップの上に、全体のドレープされる中間点で浅い「V」を除いた高さ約1〜1.5ミリメートルでなければならない障壁を（円はうまくいくかもしれません）、作る。 「V」に近い障壁のいずれかの側に生理食塩水の小さな水たまりを作る。ストレッチやピンチ神経を、皿から慎重に神経を持ち上げ、ゼリーだけでなく、石油中の生理食塩水溜りに配置しないように注意しながら。 神経の部分が露出した神経をカバーするためにワセリンを取り出し、慎重に、乾燥しないように、迅速に作業。今生理食塩水での障壁をテストし、それが漏れていないことを確認してください。 バリアの内側に生理食塩水を離れてブロットおよび入浴食塩水を2辺は（ 図8）互いに分離されていることを確認するためにワセリンの壁の周りに高いときに、それがいっぱいになるかどうかを確認します。 <stro ng>図8。 ワセリンでなく生理食塩水とPD神経がうまくまたがると 。 PDの神経はまだ切断されていません。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 ウェルは、組織紙を使用して生理食塩水を吸い取る。紙は神経を包み込むせることは避けてください。 蒸留水をいくつかの小さな滴を使用して、新しい水たまりを行い、[神経端をカット。カットの際にバリアを通過神経を引っ張らないよう十分に注意してください。蒸留水意志 "風船"軸索の浸透圧ショック。 30秒以内に、水へのCoCl 2の小滴を追加し、このソリューションを吸収した後、神経のこの短縮セクション（ 図9）上の水溜りを形成するのに十分のCoCl 2を追加します。調製物は最高の12から24時間、13℃で冷蔵保存されています。 tp_upload/51050/51050fig9.jpg "幅=" 500px "/> 図9。カットのPD神経がのCoCl 2にさらされている 。カット神経は容易になり、神経細胞体に軸索を通って色素分子の動きを加速させ、水の存在下で、最大膨潤する。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。 加湿水たまりを削除します。組織を用いたコバルト溶液を離れてブロットおよび生理食塩水を数回交換してコバルトの残骸を洗い流す。 カニの生理食塩水の約10ミリリットルを含む小さなガラスペトリ皿に単離された調製物を転送します。ニューロンを洗浄し、以下のステップがその場で行われる。良好な金属製のツールは、このステップの後に調製物を（あなたが生理用後で使用されるべきではなく、特定のツールを使用する必要がある）を処理するために使用されるべきではない。 （硫化アンモニウムの1〜2滴を加え、NH4）生理食塩水に2 S。キャップしっかりと（NH 4）2 S瓶とフードに戻し入れます。解剖顕微鏡下で準備中の反応を観察する 1〜2分以内に、コバルトで満たされた神経細胞とそのプロセスが、彼らは黒を染色するため、表示されるように開始する必要があります。 5〜10分後、新鮮な生理食塩水で開発ソリューションを交換してください。 あなたがシンク排水に注ぎました開発ソリューションを数分間、または蓋付きの廃棄ボトルに水道水を実行して続いていることを確認してください。 生理食塩水を注ぐと、ブアン液固定液を2回交換しながら約15分間の神経の準備を整えます。 （ステインテンションニューロンへの）オープナーの筋肉のような大規模な組織の場合は、30分までの固定の持続時間を増やします。 70％（ すなわち、70％、80％、90％、100％）で始まるエタノール濃度の昇順の一連の脱水する。各濃度の約10分のために十分である小さな組織。 100％エタノールを2回交換では約10〜15分後、100％のサリチル酸メチルをエタノールに置き換えることによって、組織をオフにします。準備を繰り返し表示するために恒久的にこのソリューションに留まります。周囲の組織が明確になるための時間で満たされた細胞は、より明らかになるだろう。強化法は、時間にわたって25退色防止するために使用することができる。 のCoCl 2でテンション神経を埋めるために同じプロセスを使用しています。しかし、各エタノール脱水工程でエタノール溶液を複数回変更し​​て、徹底的に筋肉を脱水し、それらをうまくクリアできるように各ステップの約20分間アルコール内側準備をインキュベートする。