Proprioception et tension récepteurs en crabe Membres: Exercices de laboratoire étudiant

Une. Dissection et enregistrement de l'activité électrique du nerf Propodite-dactylopodite (PD) Tenez le crabe dans la carapace de derrière, et en évitant les griffes, pincez la partie proximale de la meropodite avec une pince. La jambe autotomize à empêcher l'animal de saigner à mort. Faites preuve de prudence lors de la manipulation de crabes bleus car ils sont assez agressif et très rapide. Figure 1. Première étape d'un crabe marche. La localisation anatomique des organes chordotonaux (régions hachurées) sont superposées sur ce schéma. La double tête de flèche indique où sectionner la jambe pour les expériences PD nerveuses. Cliquez ici pour agrandir l'image . Faire une coupe entre le propodite et carpodite. Jeter le carpopodite et t il attachait meropodite (Figure 1). Couper une grande fenêtre dans la cuticule sur la (latéral) côté pigmentée de la propodite avec un scalpel avec une lame # 11 (figure 2 et 3). Remarque: Ne pas couper profondément. Enlever la couche de cuticule en faisant coulisser la lame de scalpel en dessous et parallèlement à la cuticule. Cela rompt les fibres musculaires attachés à la cuticule. En utilisant la même technique coupé une petite fenêtre sur le pigmentless (médiale) côté du propodite, mais laisser le condyle (le joint à rotule ou articulation entre les segments) attache intact. Figure 2. Coupez le long de la ligne pointillée sur le propodite. Cliquez ici pour agrandir l'image . n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/> Figure 3. Exposer le nerf de la fenêtre (les flèches décrivent le faisceau nerveux). Cliquez ici pour agrandir l'image . Préparer un plat Sylgard bordée contenant une solution saline de crabe à la broche de la préparation vers le bas. Remarque: Voir le tableau 1 pour les espèces recettes salées spécifiques. Localiser l'organe de PD par sondage avec soin les aiguilles de verre poli au feu. Le brin élastique recouvrant le joint a un aspect argenté. Enlever les fibres musculaires qui obscurcissent votre vision de l'organe des deux côtés du tendon. Soyez très prudent pour ne pas blesser l'organe de PD ou son nerf. Une fois cette étape accomplie, remettez fermement la préparation dans le plat avec le côté de pigment (latéral) vers le haut (figure 4). <img alt="Figure 4" fo:content-width= "5 po" src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig4.jpg" width = "500px" /> Figure 4. Exposed organe de PD et le nerf. Cliquez ici pour agrandir l'image . Suivez le nerf organe PD dans le propodite autant proximale que possible afin de libérer de longue durée de nerf (1,5 cm) à des fins d'enregistrement. Le mieux est alors le nerf de PD est encore attaché à la principale nerf de la jambe. Après la séparation du nerf PD du nerf principal de la jambe à l'aide d'aiguilles de verre, couper le nerf de PD proximale avec les iris ciseaux. Remarque: Ne pas étirer ou de tirer sur le nerf lors de la dissection. Déplacer le dactylopodite à une position étendue et entièrement fléchie. Prenez note sur l'endroit où les positions de flexion et d'extension extrêmes et un point pour une utilisation ultérieure à mi-chemin. Placez un fil de terre à l'intérieur du bain d'eau salée. Mettez le ematériel d'enregistrement lectrophysiology / logiciel. Remarque: Notre installation a été décrit précédemment 23. Placez le microscope de sorte qu'il est sur la platine du microscope. Une fois le plat de préparation est placé sur la scène, vous aurez besoin d'ajuster la position du faisceau d'éclairage de haute intensité pour mieux visualiser la préparation. Positionner le micromanipulateur afin que le montage d'électrode d'aspiration attaché aura accès facile au bain de sérum physiologique et de la préparation. L'électrode d'aspiration est réalisé sous la forme représentée sur une ligne vidéo 24. Pour détecter l'activité neuronale, tirer l'extrémité du nerf PD découpée dans l'électrode d'aspiration. Déplacez le dactyle tout au long de positions longues et fléchis pour plusieurs cycles à l'aide d'une sonde de verre ou cheville en bois. Suivant observer l'activité lorsque le dactyle est tombé dans les positions étendues, fléchis, et au milieu. 2. Enregistrement de l'activité électrique de la tensionNerf tout en surveillant de génération de forces Déterminer le côté latéral et médial de la jambe. Le côté médial a une texture douce qui peut être ressenti en pinçant doucement dans la région meropodite avec un ongle. Placez ce soft cuticule vers le haut dans le plat. Le nerf moteur de l'excitatrice qui innerve le muscle ouvreur innerve aussi le muscle civière dans le carpopodite. Afin de stimuler le muscle de l'ouvre le nerf moteur civière dans la région carpodite est isolé et stimulé avec une électrode d'aspiration. La partie proximale de la jambe est éliminé par sectionnant la meropodite avec des ciseaux. Retirer une partie de la cuticule de la région de carpe sur le côté intérieur (côté médial, figure 5A). Couper le apodeme du muscle de flexion et retirer délicatement le muscle à ne pas tirer sur le nerf principal de la jambe hors de la cavité de la jambe (figure 5B, C noter les flèches où Bender apodeme est séparé). Le nerf de la jambe principale et un soutien-gorgench au muscle civière peut alors être observé (figure 5D). Trouvez le nerf de branchement de la principale faisceau nerveux vers le muscle civière (figure 5E, à la flèche). Cela peut être coupé près du muscle et tiré dans une électrode d'aspiration pour stimuler (figures 5F et G, flèche représente la branche). Dégager une section du nerf qui se projette vers l'ouvre sans pincer le nerf. Sectionner le moteur civière / ouvreur nerf. Tirez le nerf moteur dans l'électrode d'aspiration et le stimuler. Pour exposer le muscle et le nerf ouvreur de tension retirer le muscle de fermeture et la région ventrale du propodite. Coupez le muscle de fermeture avec un scalpel avec une lame n ° 11 à la propodite (figure 6). Remarque: Ne pas couper profondément dans la région proximale, car il pourrait endommager le moteur ouvre nerf. <img alt="Figure 5" fo:content-width = "5 po" src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig5.jpg" width = "500px" /> Figure 5. Étapes de dissection pour exposer le neurone moteur pour stimuler le muscle ouvreur. Cliquez ici pour agrandir l'image . Figure 6. Couper la cuticule sur la moitié ventrale du propodite pour exposer le muscle de fermeture de sorte qu'il peut être retiré. Cliquez ici pour agrandir l'image . Remplacez la solution saline avec une solution saline refroidie fraîche tout au long du processus de dissection de garder les neurones en vie. Pour de plus amples dissection, placez le plat de la préparation sous un microscope à dissection et utiliser un éclairage par fibre optique. Découpez soigneusement le tendon près de son attachement àle dactyle utilisant pointues ciseaux de taille moyenne. Soyez très prudent de ne pas perturber les branches vers le muscle ouvreur du nerf principal de la jambe qui doit être clairement visible. Retirer et jeter le muscle de fermeture et le tendon. Faire un trou dans le dactyle avec une épingle de dissection. Ce trou sera utilisé par la suite pour raccorder la tige de métal sur la tension (force) transducteur, mais il est nécessaire de le faire à ce stade de la procédure. Repérez la branche du nerf qui projette vers le muscle ouvreur et apodeme dans la région distale du muscle ouvreur. Sonder soigneusement le nerf avec l'outil de verre poli-le-feu. Observer le nerf de la tension qui résulte de l'extrémité distale de la apodeme et procède au faisceau du nerf moteur. Pour détecter l'activité neuronale, remplir une électrode d'aspiration avec une solution saline de crabe et dessiner la fin de l'ouvreur tension nerf coupé dans l'électrode. Assurez-vous que l'électrode d'aspiration est bien serrée sur le nerf. Examinez la NEURAl corrélat de tension passive sur le apodeme d'ouverture. Pendant l'enregistrement de l'activité électrique du nerf de la tension, tourner le dactyle rapidement dans une commune étendue (c.-à-étirement du muscle d'ouverture). Ensuite, essai le développement de la force active par rapport à la fréquence de stimulation. Attachez fermement un crochet métallique de sorte que la pointe de l'hameçon passe par un petit trou dans le dactyle. . Branchez l'autre extrémité du crochet de métal pour le capteur de force Remarque: Assurez-vous que le transducteur est à un angle de 90 ° à chaque fois pour que la tige est perpendiculaire à la sonde de détection maximale de la force générée. Tirer le crochet et le dactyle de sorte qu'il est à peu près un angle de 45 ° de l'articulation de l'ouvre. Maintenant stimuler le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension. Placer le joint dans une position complètement déployée de sorte que les fibres musculaires sont ouvreur flasque. Stimulate le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension. Bend / flexion de l'articulation de sorte qu'elle soit entièrement fléchie (~ 90 °). Dans cette position, les fibres musculaires de l'ouvre-porte sont entièrement étirés. Il peut y avoir une certaine force mesurée par le transducteur du fait de cet étirement passif du muscle. Stimuler le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension. Après la mesure de la force, de procéder à une série de fréquences différentes: 20, 40, 60, 80 et 100 Hz pendant 8 à 10 secondes dans chaque position de joint. Mesurer la réponse d'un relâchement de la tension rapide. Disposer la préparation de telle sorte que le crochet sur le transducteur de force peut être facilement poussée hors du trou dans le dactyle. Bend / flexion de l'articulation de sorte qu'elle soit entièrement fléchie (~ 90 °). Maintenant stimuler le nerf moteur à 100 Hz avec une stimulation continue de 5 sec. Après la première seconded ou moins, alors que la tension s'est accumulée sur le muscle d'ouverture, pousser la tige du trou dans le dactyle. Examiner l'enregistrement de nerf de tension avant et après la libération de la broche tenant le dactyle. Effets modulateurs de substances telles que la neuro-actifs octopamine, la sérotonine, et proctoline, ce qui modifie le signal de sortie des neurones de tension, peuvent être déterminés par l'addition de ces molécules à la presse de bain sur le muscle de l'ouvre-exposée et la répétition des expériences. Utiliser une pipette et goutte à goutte 1-2 ml au cours de la préparation. 3. Structures du système nerveux périphérique coloration de crustacés Jambes pied Technique de bleu de méthylène Diluer la solution mère de chlorure de méthylène bleu un de partie (0,25%) avec deux parties d'eau distillée. Ajouter ce mélange à cinq parties de solution saline tamponnée. Bien irriguer la zone d'intérêt. Disséquer une jambe selon le protocole à l'article 1. Incuber la préparation de la solution de bleu de méthylène à 12-13 ° C. Examiner la préparation toutes les 10-15 min avec le microscope à dissection en utilisant un éclairage de faible intensité pour suivre l'évolution de la coloration. Dans certains cas, la coloration sera terminé en une heure, dans d'autres, cela peut prendre du jour au lendemain. Technique 4-di-2-ASP Les colorants fluorescents peuvent être utilisés pour remblayer le neurone de PD ou teindre directement la préparation de la salle de bain. Toutefois, un microscope adapté aux capacités de voir le colorant fluorescent est nécessaire. Disséquer une jambe selon un protocole à l'article 1. Incuber la préparation à une concentration de 10 uM de solution de 4-Di-2-ASP et laisser la préparation dans le réfrigérateur pendant 15 min. Utilisez juste assez de solution pour couvrir la préparation. Photographier les préparatifs rapidement et éviter la surexposition à la lumière de mercure. Ce colorant fluorescent s'estompe assez rapidement. <li> Technique de chlorure de cobalt Exposer le nerf de PD selon le protocole de l'article 1 et le maintenir immergé dans une solution saline froide. Faire une gelée de pétrole et de tenir le CoCl 2. Si tout CoCl2 se déverse dans le bain d'eau salée toute la préparation va tacher noir, et la préparation doit être jeté. Glisser une petite incision d'une feuille de polystyrène, de faire une plate-forme de matière plastique, et la broche d'une manière telle qu'il ne sera pas flotter ou être immergé dans le bain de solution saline (figure 7). Feuille Figure 7. Polystyrène avec des épingles à tenir en place dans le plat. Cliquez ici pour agrandir l'image . Éjecter la gelée de pétrole à partir d'une fine aiguille hypodermique fixée à une seringue jetable,puis faire une barrière (un cercle pourrait bien fonctionner), qui devrait être d'environ 1-1,5 mm de hauteur, sauf pour un "V" profond au milieu où le nerf sera drapé sur, au-dessus du bout de polystyrène. Faites une petite flaque d'eau salée de chaque côté de la barrière près de la "V". Prendre soin de ne pas étirer ou pincer le nerf, lever le nerf soin du plat et le placer dans la flaque d'eau salée dans la vaseline bien. Travaillez rapidement de sorte que la section de nerf ne se dessèche pas, soigneusement éjecter la gelée de pétrole pour couvrir le nerf exposé. Maintenant, testez la barrière avec une solution saline et assurez-vous qu'il ne fuit pas. Épongez loin saline à l'intérieur de la barrière et voir si elle se remplit lorsque la saline de bain est grande autour de la paroi de la gelée de pétrole pour être sûr que les deux parties sont isolées l'une de l'autre (figure 8). <stro ng> Figure 8. Vaseline bien avec une solution saline et PD nerf enjambant le bien. Le nerf PD n'a pas encore été coupé. Cliquez ici pour agrandir l'image . Évacuer la solution saline dans le puits à l'aide d'un morceau de papier de soie. Évitez de laisser le papier envelopper le courage. Faire une nouvelle flaque d'eau à l'aide de quelques petites gouttes d'eau distillée, puis couper l'extrémité des nerfs. Soyez très prudent de ne pas tirer sur le nerf à travers la barrière pendant la coupe. Le choc osmotique de l'eau distillée "ballon" des axones. Dans les 30 secondes ajouter une petite goutte de CoCl2 à l'eau, absorber cette solution, puis ajouter suffisamment CoCl 2 pour former une flaque d'eau au cours de cette section raccourcie de nerf (figure 9). Les préparatifs sont mieux conservés au réfrigérateur à 13 ° C pendant 12-24 h. tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/> Figure 9. L'PD nerf coupé est exposé à CoCl 2. Le nerf coupé gonfle en présence d'eau qui facilite et accélère le mouvement des molécules de colorant à travers les axones dans les corps cellulaires des neurones. Cliquez ici pour agrandir l'image . Retirez les flaques d'humidification. Épongez loin la solution de cobalt en utilisant un tissu et laver les restes de cobalt avec plusieurs changements de solution saline. Transférer la préparation isolée à une petite boîte de Petri en verre contenant environ 10 ml de solution saline de crabe. Les neurones sont lavés et les étapes suivantes sont effectuées in situ. De bons outils métalliques ne doivent pas être utilisés pour gérer la préparation après cette étape (vous devez utiliser des outils spécifiques qui ne sont pas à utiliser à une date ultérieure pour la physiologie). Ajouter 1-2 gouttes de sulfure d'ammonium (NH4) 2 S à la solution saline. Boucher le (NH 4) 2 S flacon et remettez-les dans la hotte. Observer la réaction lors de la préparation sous un microscope à dissection Dans 1-2 min, les neurones de cobalt-remplie et leurs processus devraient commencer à apparaître car ils peuvent tacher noir. Après 5-10 minutes, remplacer la solution de développement avec une solution saline fraîche. Assurez-vous que la solution de développement, vous avez versé dans l'évier est suivi par l'eau du robinet pendant quelques minutes ou dans une bouteille de déchets avec un couvercle. Verser la solution saline et fixer la préparation de nerf pendant environ 15 min avec deux changements de solution fixateur de Bouin. Pour les plus grands tissus comme les muscles d'ouverture (pour colorer les neurones de tension), augmenter la durée de fixation à 30 min. Déshydrater dans une série de l'ordre croissant de concentration de l'éthanol à partir de 70% (soit 70%, 80%, 90%, 100%). Environ 10 min à chaque concentration est suffisante pourpetits tissus. Après environ 10 à 15 min dans deux changements d'éthanol à 100%, effacer le tissu par le remplacement de l'éthanol à 100% de salicylate de méthyle. La préparation va rester dans cette solution permanente pour la visualisation répétée. Avec le temps, les cellules remplies apparaîtront mieux parce que le tissu environnant deviendra plus clair. méthodes de densification peuvent être utilisés pour aider à prévenir la décoloration au fil du temps 25. Utilisez la même procédure pour remplir le nerf de tension avec CoCl 2. Cependant, changer la solution d'éthanol à plusieurs reprises dans chaque étape de déshydratation de l'éthanol et incuber la préparation à l'intérieur de l'alcool pendant environ 20 minutes pour chaque étape de déshydrater complètement les muscles et de leur permettre de bien dégager.