Nucleofection из грызунов нейробласты по изучению нейробласта миграции<em> В пробирке</em

Эта процедура в соответствии с МВД Великобритании Положения (Закон Животное научных мероприятиях, 1986). Ученые должны следовать принципам, установленным и утвержденным их институциональных и национальных регулирующих организаций животных. 1. Вскрытие и диссоциация Rat RMS нейробласты Подготовьте решения, необходимые для RMS вскрытия и диссоциации: Вскрытие среда (100 мл) Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) – 98,5 мл 5 М HEPES рН 7,4 – 0,5 мл Пенициллин-стрептомицин (10000 единиц / мл и 10000 мкг / мл) – 1 мл Разобщенность среда (2 мл) ССРХ – 1,760 мл 10x Трипсин (2,5%) – 200 мкл DNAse1 (1 мг / мл) – 40 мкл Дульбекко изменения Игла (DMEM) + 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) (40 мл) DMEM -36 мл ФТС – 4 мл Полная среда (12 мл) Neurobasal средний – 11,46 мл B27 Дополнение – 250 мкл L-глютамин (200 мм) – 125 мкл Глюкоза (45%) – 165 мкл 2. Фильтр-стерилизовать DMEM + 10% FCS и полной среды и preequilibrate их в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора. Рассечение Пожертвуйте крысы мусор P6-P7 (около 12 щенков) путем смещения шейных позвонков и обезглавить ножницами. Сделать передне-заднего разрез в коже вдоль середины стреловидного шва от носа до мозжечка с лезвие скальпеля. Очистите кожу с и повторить ту же надрез вдоль черепа. Аккуратно удалите черепные закрылки пинцетом и аккуратно снимите мозг с помощью шпателя, заботясь, чтобы включить обонятельные луковицы. Разрежьте наиболее хвостовой треть мозга и выбросьте его. Чоп-еэ ткани мозга в 1,4 мм толщиной корональных ломтиками, используя ткани вертолет. Поместите ломтики в блюдах, содержащих холодной рассечение среды и осторожно отделить их с помощью иглы. Номинальная появляется как треугольные, полупрозрачной области в центре ОВ секциях и как небольшой, круглой области в более каудальных срезах мозга. Разрежьте RMS из каждого среза с микрохирургической ножом, стараясь не допустить включая окружающие ткани. В P7 крысят, как правило, ~ 8 самых Ростральные ломтики (включая OB) содержат RMS. Соберите фрагменты RMS с пластиковой пипетки Пастера и поместите их в небольшое блюдо, содержащей холодной рассечение среды на льду. Когда рассечение завершена, передавать фрагменты RMS в 15 мл трубки с пластиковой пипетки. Оставьте фрагменты оседают на дне пробирки. Диссоциация Замените рассечение среду с 2 мл диссоциации среды. Растирают фрагменты RMS, осторожно рipetting подвеску фрагмент вверх и вниз примерно в 10 раз, используя P1000 пипетки. Оставьте трубку с фрагментами тканей в C водяной бане 37 ° в течение 2 мин. Внесите решение снова 10x и убедитесь, что фрагменты в отрыве (подвеска должна мутнеет). Инактивации трипсина путем добавления 5 мл предварительно нагретого DMEM + 10% FCS. Центрифуга клеточной суспензии в 433 х г в течение 5 мин. Тем временем аликвотой необходимое количество миРНК / ДНК в пробирки Эппендорф (обычно 3-5 мкг ДНК / shRNA или 5-9 мкг миРНК олиго за nucleofection, однако количество ДНК / миРНК может потребовать оптимизации). Удалите излишки среды и ресуспендируют осадок клеток, осторожно пипеткой в ​​5 мл нагретого DMEM + 10% FCS. Выполните число клеток. Ожидайте ~ 1 х 10 6 клеток на крысят мозг. Минимум 2,5 х 10 6 клеток, необходимых для каждой nucleofection, в то время какОптимальные результаты достигаются при использовании 3-4 х 10 6 клеток на nucleofection. Центрифуга клеточной суспензии в 433 х г в течение 5 мин. Убедитесь в том, чтобы удалить столько среду, насколько это возможно. 2. Nucleofection Сразу ресуспендируют осадок клеток в крысы или мыши (при использовании клетки мыши) нейронов nucleofection раствор предварительно инкубируют при комнатной температуре. Используйте 100 мкл на nucleofection Примечание:. Обычно крыса помет из 12 щенков достаточно выполнить 4 nucleofections и помет мыши (12 щенков) достаточно выполнить 2 nucleofections. Трансфер 100 мкл клеточной суспензии в каждую пробирку Эппендорф, содержащей миРНК / ДНК и аккуратно перемешать 2-3x с помощью пипетки с P200 пипетки. Добавить образец (cell-DNA/siRNA суспензи), в нижней части nucleofectioncuvette, избегая пузырьков. Nucleofect помощью программы G-013 (для крыс клетки) или O-005 (дляклетки мыши). Один nucleofection занимает около 5 сек. Быстро добавить 1 мл нагретого DMEM + 10% FCS в nucleofected образца. Повторите шаги 2.4 и 2.5 для всех других образцов. Примечание: для достижения оптимального результата, вся процедура nucleofection должны длиться не более 5 мин. Передача каждого образца в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл предварительно нагретого DMEM + 10% FCS с помощью пластиковой пипетки, представленную комплекта nucleofection. Избегайте передачи любой распада клеток к трубе. Центрифуга образцов при 433 мкг в течение 5 мин. Осторожно снимите все лишние среды и ресуспендируют осадок в 25-30 мкл нагретого DMEM + 10% FCS с использованием P20 пипетки. Не используйте более 30 мкл среды. Пипетки подвеску в виде капли на внутренней стороне посудомоечной p35 крышкой. Переверните крышку над p35 блюдо с 2 мл полной среды (см. также рисунок 1). Оставьте в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) в течение нене менее 5 ч и до 7 часов. Более длительное время инкубации позволяет лучше реагрегация клеточных кластеров. Перенесите висячей капли с крышки в полной среде в блюдо с использованием P1000 пипетки с вырезом чаевых. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 24 ч в течение nucleofections ДНК и 48 часов для миРНК / shRNA nucleofections. 3. Встраивание Подготовить всю среду (25 мл) и preequilibrate его при 37 ° C / 5% CO 2 в течение нескольких часов. Выньте замороженные аликвоты базальной мембраны матрицы от -80 ° C морозильник и таять на льду в холодной комнате. Для каждого nucleofection подготовить чашку диаметром 6 см, содержащую до восьми 13 мм стерильные coverlips. Поместите посуду на лед коробки покрыта пищевой пленкой. Важно, чтобы держать покровные здорово, чтобы предотвратить затвердевание матрицу во время процедуры вложения. Для поддержания влажности, поместите полоску влажной ткани внутри 15 см блюдо, что шплохо быть использован для хранения до трех 6 см блюд, содержащих встроенные нейробласты. Добавить полной среды в талой матрицы в соотношении 1:03. Например, смешайте 40 мкл полной среды с 120 мкл матрицы с помощью пипетки. Это количество матрицы достаточно для встраивания агрегатов на восьми 12 мм покровные. Перенесите кластеры reaggregated клеток к 15 мл трубки и центрифуге при 433 мкг в течение 5 мин. Удаление избытка среды и ресуспендируют осадок в 10 мкл полной среды. Поместите 2 мкл клеток совокупного подвески на каждый стерильной покровного и добавить 18 мкл матрицы / полного среднего смеси. Используйте пипетки распространять матрицу по всей покровное. Сразу же место 6 см блюдо, содержащее покровные в 15 см блюдо и оставить в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) в течение 15-20 мин. Когда матрица укрепил, мягко добавить 5 мл полной среды для каждого 6 см ухода блюдо принимая нажатьвниз любой плавающей покровного с кончика пипетки. Инкубировать в течение 24 часов при 37 ° C / 5% CO 2, чтобы нейробласты мигрировать из клеточных агрегатов. 4. 3D Анализ миграции Подготовьте решения, необходимые для иммунной окраски. Подготовьте блок решение: Коза блок раствор (50 мл) Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) – 5 мл Коза сыворотки – 7,5 мл 10% Triton X-100 – 1,5 мл БСА – 50 мг H 2 O – 36 мл Фильтр и хранить при температуре 4 ° C. Подготовьте крепежную решение: Фиксирующим раствором (100 мл) Параформальдегид (PFA) – 4 г ВНИМАНИЕ: всегда обращаться PFA под капотом Сахароза – 20 г (по желанию) PBS до 100 мл На горячей плите и при постоянном перемешивании растворить PFA в 80 мл PBS при 65 ° C. После того, как PFA растворится, добавить 20 г сахарозы. Отрегулируйте рН до7,4 (обычно путем добавления ~ 60 мкл 1 М NaOH на 100 мл раствора). Подогреть до общего объема 100 мл с PBS. Иммуноокрашивание Наведите покровные в 24-луночный планшет. Промыть покровные с PBS 2х. Fix нейробласта агрегаты RMS с фиксирующим раствором в течение 45 мин при комнатной температуре. Промыть покровные с PBS 3 раза (5 мин / мыть – на качающейся платформе). Блок в течение 30-60 мин с козел блока решения. Развести первичных антител в блоке решения козьего и инкубировать в течение ночи при 4 ° С. (При желании флуоресцентный фаллоидином (1:400) и Hoechst краситель (1:10000) также может быть добавлен к раствору первичного антитела для визуализации нитчатые актина и ядер). Промыть покровные с PBS 3 раза (5 мин / стирки). Развести вторичных антител в растворе блока козы и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Промыть coversliпс с PBS 3 раза (5 мин / стирка) Гора покровные с флуоресцентным монтажной среды и оставить для высыхания на ночь при комнатной температуре. Анализ миграции Захват изображения фиксированных RMS нейробластов агрегатах с флуоресцентным микроскопом с использованием объектива 10х. Включают в себя бар накипи в выборочной изображения. Чтобы настроить масштаб для количественного, измерить бар масштабный в изображении, выбрав 'прямой линии' инструмент на панели ImageJ инструмента. Выберите опцию 'Анализ' и нажмите 'установленной шкале ". В окне шкалы установить 'известное расстояние' и отметьте "глобального" флажок, чтобы сохранить те же настройки для всех измерений. Используйте "сегментированные строки 'инструмент на панели ImageJ инструмента, чтобы измерить расстояние от края совокупности к самой дальней мигрировали нейробласта в 6 различных секторов за всей совокупности (рис. 3В). Рассмотрим только изолированными НПgregates для анализа. Рассчитать среднее расстояние миграции из 6 значений, полученных для каждого агрегата. Измерьте 10-20 агрегатов для каждого условия в каждом независимом эксперименте и бассейн результатов как минимум трех независимых экспериментов. Всегда включайте управления nucleofection (например. GFP или управляющий ш / миРНК).