Инновационный метод для экзосома количественной и измерения размера
Özet
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
Точное функция циркулирующих экзосом оставалось неизвестным в течение длительного периода времени. Даже сейчас полноценный механизм путь экзосом до конца не изучен. С экзосомы нести антигены, белки и РНК (мРНК и микроРНК), что связывает их с их родителей ячейке происхождения, их функции в качестве передатчиков сигнализации межклеточных в основном уделялось приоритетное внимание.
Многие различные методы были описаны в литературе для выделения и количественного определения экзосом 1,2. Тем не менее, нет единого мнения на "золотого стандарта" не была достигнута. Между тем большинство ученых, работающих в области экзосома исследования соглашаются, что последовательный метод изоляции высоко оправданным для достижения более высокой степени сопоставимости между различными докладов и исследований.
Активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) является наиболее распространенным и широко распространены инструмент для анализа экзосома 3. FACS имеет бенefit, что, с помощью флуоресцентного мечения, клетки различного происхождения могут быть сопоставлены в одну стадию. Основными недостатками являются FACS, что этот метод не достаточно чувствительны, чтобы определить частиц меньше, чем 0,5 мкм 4, в то время как экзосомы как правило, от 30-120 нм в диаметре 5, даже меньше, чтобы измерить их размер.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и другие инструменты для анализа размера частиц и морфологии экзосом. Тем не менее, как СЭМ и ТЭМ имеют тот недостаток, что подготовка проб которое отнимает много времени, оба метода включают трудоемкие стадии, и каждая имеет некоторый риск артефактов поколения. Ни метод пригоден для высокой пропускной способности и характеристик нескольких тысяч отдельных частиц одного образца пробы. Кроме того, количественный анализ в клинической повседневной жизни, где образцы часто будут анализироваться одновременно или, по крайней мере, в течение очень короткого периодатрудно выполнить. Методы нового поколения теперь позволяют нам анализировать экзосомы без предварительного напряженной подготовительной работы (например, окружающей среды SEM). Эти современные методы все еще довольно неудобно для анализа больших суспензий, объем, содержащий экзосомы, чтобы определить их среднее число и распределение по размерам 6.
Другим весьма чувствительным методом для визуализации и анализа экзосом является наночастиц отслеживания анализ (NTA). Этот способ использует преимущества двух различных принципов физики. Во-первых, частицы будут обнаружены с помощью света, рассеянного при их облучении лазерным лучом. Второй явление известно как броуновское движение, в соответствии с которым диффузии различных частиц в жидкой суспензии обратно пропорциональна их размеру. В последнем случае движение также зависит от температуры и вязкости жидкости. Тем не менее, этот показатель напрямую связан с размером частиц и используется НТА. Использование мягкойИзделия на основе анализа, цифровые изображения рассеянного света от одиночных частиц записываются. Земельные участки рассеянных световых пятен и их скорость движения обеспечивают данными, которые облегчают определение общего количества частиц и распределением по размерам. Этот метод особенно мощным для анализа частиц со средним диаметром менее 100 нм.
Измерения размеров и концентрации осуществляется с ZetaView броуновского и электрофорез движения видео микроскопического анализа. Это полуавтоматический настольный наночастиц инструмент для анализа жидких образцов (далее, как отслеживая инструмент частиц). Он состоит из отслеживания анализатора частиц, а также ноутбук с программным обеспечением, используемым для анализа данных. Гетерогенные биологические образцы в качестве пригодных для этого метода, как более однородных суспензий неорганических частиц. Рассеяния лазерного излучения микроскопа с видеокамерой, используется для обнаружения частиц и для OBSErvation их движения. В то время как ось микроскопа горизонтально и направлены в канал ячейку, заполненную суспензией, содержащей экзосомы, лазерный луч направлен вертикально. Частицы облучении лазерным разброса света, который регистрируется в соответствии с 90 ° с цифровой видеокамеры с помощью микроскопа (рис 1). Интенсивность рассеянного света позволяет наблюдать частицы большего диаметра 60 нм. В такой обстановке яркость частицы не только указание размера частиц. При отсутствии электрическое поле не приложено, движение частиц только следует броуновское движение, и может служить индикатором для вычисления размера частиц. Тем не менее, прибор также может подаче электрического поля через клеточную канала. При воздействии этой области, потенциал, полярность и уровень ионной заряда взвешенных экзосом стать еще детерминанты направлении их движения. Скорость и результат направление в электрофоретической месяцевность гистограмма.
Хотя найти оптимальный метод для анализа изолированных экзосомы одна проблема, еще один находится в эффективной изоляции экзосом из различных средств массовой информации, таких как кровь, асцит, мочу, молоко, амниотической жидкости или клеток массовой информации. Различные способы были описаны до сих пор, которые основаны на ультрацентрифугирования 1, промышленные реагенты разделения (например, Exoquick) 7, магнитные шарики для антигена, использующей разделение 8 или 9 ультрафильтрации шаги.
В этом протоколе мы демонстрируем весь процесс изоляции экзосома через ультрацентрифугированием и показать, как анализировать полученную экзосома, содержащий суспензию с помощью отслеживания частиц инструмента. Особые соображения для анализа человеческой плазмы или клеточной культуральной среды, полученных экзосом предоставляются.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем подробный протокол для экзосома изоляции от крови и настоящим отслеживания наночастиц в качестве нового и инновационного метода измерения размера экзосома и концентрацию в биологической жидкости. В представленных экспериментах периферической крови человека использовали в качестве происхождения экзосом. Тем не менее, другие происхождение, такие как моча, мокрота, супернатант клеточной культуры и т.д., также могут быть использованы в качестве тестового материала.
Основываясь на биологической изменчивости концентрации экзосома у людей анализы из разных людей может обладать удивительно изменению концентрации экзосом. Тем не менее, концентрация частиц в биологических тест-пробы, может оказать влияние на результаты. Таким образом, надежность и стандартизированный подход для разбавления проб необходимо. В представленном способе экзосом содержащий плазмы, полученные от 9 мл периферической цельной крови. Использование дифференциального центрифугирования шаги экзосом осадок, выделенный из1 мл плазмы, и ресуспендировали в 5 мл дистиллированной воды, чтобы привести в рабочее образца взвешенных экзосом. Это предустановленных настроек предоставил нам с надлежащей концентрации частиц, т.е. соответствующей интенсивности рассеяния во НТА. Кроме объема и разбавления аспекте композиция из решений, которые используются также имеет значение. Мы использовали дистиллированную воду для окончательного ресуспензии экзосом. Конечно, различные носители для окончательной стадии разбавления также могут быть использованы, в соответствии с требованиями экспериментальной установки. Тем не менее, в случае дзета-потенциал измерений ионной решений, в частности, при тестировании образцов с буферной емкости, разбавление в разумных турбулентности свободных условиях полезно. Для прямого сравнения нескольких образцов мы рекомендуем держать тот же уровень разбавления для всех образцов. Все настройки, кроме чувствительности и разрешению видео может быть изменен после с помощью программного обеспечения ZetaView анализа.
<p class="Jove_content"> Хотя авторы считают, что здесь введенная система в настоящее время представляет собой наиболее подходящий инструмент, это не единственный доступный система NTA. Количество предыдущих докладах использовали другие системы, которые применяются те же принципы НТА, но обеспечивают другой дизайн инструмент, который идет вместе с некоторыми различных функций 10. Мы считаем, что практические аспекты, касающиеся обращение с пробами и воспроизводимость результатов имеет решающее значение в выборе методологической последовательности для оценки экзосома. Мы также считаем, что идеальная система обнаружения должна устранить пользователем в зависимости факторов, которые могут повлиять на результаты измерений. Экзосом анализа подход, который представлен здесь выполняет критерий простоты управления в высокой степени. В качестве дополнительного преимущества, полуавтоматическое анализ образцов выполняется в быстром процессе, генерировать результаты в короткий промежуток времени. Онлайн визуализация экзосом помогает анализатор Г.А.в одно мгновение идеи экзосом характеристик, например, валовой концентрации.Очень простой, но элегантный дополнение к измерительной технике, представленной здесь является использование антител помечены экзосом и захвата рассеянного лазерного луча с помощью предыдущим фильтром перед детектором. Таким образом экзосома субпопуляции можно выделить в соответствии с их поверхностных антигенов и других биологически соответствующих характеристик, которые технически доступны селективного флуоресцентного окрашивания.
Одним из недостатков текущей версии нашей отслеживания частиц инструмента является то, что при очень высоких уровней чувствительности артефакты, такие как фоновый шум может стать настоящее, который основан на стенке канала клеток. Техническое решение и улучшение существующей системы могут стать доступны в ближайшем будущем. С помощью этого метода отражений лазерного рассе ни света на стенки канала будет уменьшен, тем самым увеличивая Точность измеряемых сигналов и полученных данных и снижения предела обнаружения.
Хотя в настоящее время используется протокол для изоляции экзосома хорошо известна и применяется отслеживания частиц Прибор имеет чрезвычайно точное решение с распределением по размерам нижней части 30 нм, что нет никакой гарантии, что обнаруженные частицы действительно совсем верно экзосомы. Другие частицы, такие как клеточные фрагменты мертвых или больших белковых комплексов могут также присутствовать в экзосома суспензии и привести к ложных положительных сигналов. Один надежный способ, с помощью которого, например "загрязнение" может быть исключено, может быть электронной микроскопии (ЭМ), либо Е. передачи или сканирования ЭМ. К сожалению, ни вообще и специфическим маркером для экзосом выявлено не было до сих пор, хотя ряд ранее предложенных поверхностных маркеров получили большее количество внимания, в том числе Тетраспанины (Tspan), CD81, C63, CD9 и т.д. 11.
"> Независимо от дальнейшего прогресса исследований по экзосома биологии, особенно в отношении экзосома специфические маркеры, протокол, который представлен здесь даст мощный метод для выделения и обнаружения экзосом. Концентрация и размер могут быть легко определены в программно-помощь просто мода. Добавление селективных флуоресцентных маркеров или флуорофорных сочетании антител, скорее всего, дальнейшего повышения возможности применения представленной подхода НТА.Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referanslar
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
