엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법
Özet
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
순환하는 엑소 좀의 정확한 기능은 장기간 동안 알려지지 남았다. 지금도 엑소 좀의 전체 경로 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 엑소 좀을 가지고 있기 때문에 항원 단백질과 원산지 그들의 부모 세포, 세포 – 세포 신호 송신기로 그 기능에 관한 RNA (mRNA와 miRNA의)를 중심으로 우선 순위를 부여하고있다.
많은 다른 방법은 분리 및 1,2- 엑소 좀의 정량적 검출을 위해, 문헌에 기술되어있다. 그러나, '황금 표준'에 대한 합의에 도달 없습니다. 한편 엑소의 연구 분야에서 활동 과학자의 대부분은 격리의 일관된 방법은 매우 다른 보고서와 연구 사이의 비교의 높은 수준을 달성하기 위해 보증에 동의합니다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 엑소 분석 3 가장 일반적이고 널리 도구이다. FACS는 벤있다형광 라벨을 통해, 상이한 기원의 세포가 하나의 단계에서 비교 될 수있다을 더할. FACS의 주요 단점은 더 적은 크기를 측정하기 위해, 엑소 좀은 직경 5 30 ~ 120 nm의 사이에 일반적으로 반면이 방법은, 입자보다 작은 0.5 μm의 4를 식별 할 수있을만큼 민감하지 점이다.
주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과형 전자 현미경 (TEM)은 입자 크기 및 형태의 엑소 좀의 다른 분석을위한 도구이다. 그러나, SEM 및 TEM 모두 샘플의 준비 시간이 많이 소요, 두 방법 모두 노동 집약적 인 단계를 포함 할 수있는 단점을 가지고 각각의 이슈 생성 될 위험이있다. 어느 방법은 높은 시료 처리 한 시료의 단일 입자의 수천의 특성에 적합하다. 더욱이, 샘플이 종종 임상 일상 용 정량 분석은 매우 짧은 기간에 동시에 또는 적어도된다 분석 할수행하기 어렵다. 차세대 기술은 지금 우리가 이전에 집중적 인 준비 작업 (예를 들어, 환경 SEM)없이 엑소 좀을 분석 할 수 있습니다. 이러한 최신 기술은 여전히 평균 개수 및 크기 분포를 결정하기 위해 6 엑소 좀을 대량 함유 현탁액을 분석 오히려 불편하다.
시각화 및 엑소 좀 분석을위한 또 다른 매우 중요한 방법은 나노 입자 추적 분석 (NTA)입니다. 이 방법은 물리학의 두 가지 원칙을 활용합니다. 먼저, 입자들이 레이저 빔이 조사 될 때 빛 산란에 의해 검출된다. 두 번째 현상은되는 따른 액체 현탁액 중의 입자들의 상이한 확산의 크기에 반비례하는, 브라운 운동으로 알려져있다. 후자의 경우, 이동도의 온도 및 액체의 점성에 의존한다. 그러나, 이러한 속도는 직접 입자 크기와 관련이 NTA에 의해 사용된다. 부드러운 사용웨어 기반의 분석은 단일 입자 산란광의 디지털 이미지가 기록됩니다. 산란 광 스폿의 플롯과 그들의 모션의 속도는 입자의 총 개수 및 크기 분포의 결정을 용이하게 데이터를 제공한다. 이 기술은 100nm 이하의 평균 입자 직경을 분석하는데 특히 강력하다.
크기와 농도 측정은 ZetaView 브라운과 전기 영동 모션 비디오 분석 현미경으로 수행됩니다. 이것은 (이하, 입자 추적기구 라 함), 액체 시료 반자동 탁상 나노 분석 도구이다. 이는 입자 분석기 추적뿐만 아니라, 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어 노트북 이루어져있다. 이기종 생물학적 시료는 무기 입자의 더 균일 한 현탁액으로이 방법으로 적합하다. 비디오 카메라와 레이저 산란 현미경은 입자의 검출 및 obse에 사용그들의 운동의 rvation. 현미경 축이 수평 및 엑소 좀을 함유하는 현탁액으로 채워진 셀 채널에 초점을 맞추고 있지만, 레이저 빔은 수직 배향된다. 현미경 (도 1)를 통해 디지털 비디오 카메라에 의해 90 ° 아래에 기록되어, 레이저 광의 산란에 의해 조사 된 입자. 산란광 강도는 60 나노 미터보다 큰 입자 지름의 관찰을 허용한다. 이러한 설정에서 입자의 밝기 입경 용임 아니다. 어떠한 전계가인가되지 않는 경우, 입자 운동은 브라운 운동을 다음과 입경을 산출 지표로서 역할을 할 수있다. 그러나, 장비는 또한 셀의 채널을 가로 질러 전기장을인가 할 수있다. 이 필드를 실시 할 때, 전위, 극성 및 현탁 엑소 좀의 이온 전하의 레벨은 이동 방향의 상기 결정된다. 전기 영동 개월의 속도와 방향 결과내구 히스토그램.
고립 된 엑소 좀을 분석 할 수있는 최적의 방법을 찾는 것이 하나의 문제이지만, 또 다른 하나는 혈액, 복수, 소변, 우유, 양수 또는 세포 미디어 등 다양한 매체에서 엑소 좀의 효과적인 분리에있다. 다른 방법은 초 원심 (1)에 기초하는, 지금까지 설명되었다 (예 Exoquick 등) 산업 분리 시약 (7), (8)의 분리 또는 한외 여과를 이용한 항원 자성 비드 9 단계.
이 프로토콜에서는 초 원심 분리를 통하여 엑소의 전체 과정을 설명하고, 입자 트래킹기구를 통해 현탁액을 함유하는 생성 된 엑소 좀을 분석하는 방법을 보여준다. 인간 혈장 또는 세포 배양 배지 유래 엑소 좀의 분석에 대한 구체적인 고려 사항이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 생물학적 유체 엑소 크기와 농도를 측정 할 수있는 새롭고 혁신적인 방법으로 혈액와 현재의 나노 입자 추적에서 엑소 분리에 대한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 실험에서는 인간 말초 혈액 엑소 좀의 원점으로 하였다. 그러나 등과 소변, 객담, 세포 배양 상등액, 다른 기원, 또한 시험 물질로서 사용될 수있다.
인간에서 엑소 농도의 생물학적 다양성에 기초하여, 다른 개인의 분석은 엑소 좀의 다양한 농도를 현저하게 마련되어있다. 그러나 생물학적 검사 프로브 입자의 농도는 결과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 프로브의 희석 신뢰성 있고 표준화 된 접근 방식이 필요하다. 제시된 방법은 엑소 포함하는 플라즈마는 주변 전체 혈액의 9 ml의에서 생성되었습니다. 차등 원심 분리를 사용하여 엑소 좀 펠렛으로부터 분리 된 단계1 ml의 혈장과는 현탁 엑소 좀의 작업 샘플을 파생한다고 증류수 5ml에 재현 탁. 이 사전 정의 된 설정은 입자의 적절한 농도, NTA 동안 즉, 적절한 분산 강도와 함께 우리를 제공하고 있습니다. 볼륨 및 희석 양태 게다가, 사용되는 용액의 조성은 또한 중요하다. 우리는 엑소 좀의 최종 다시 서스펜션 증류수를 사용했다. 물론, 최종 희석 단계에 대해 다른 매체는 실험 장치의 요구 사항에 따라 이용 될 수있다. 그러나, 완충 능력을 시험 샘플과 함께, 특히 이온 용액의 제타 전위 측정의 경우, 난류없는 조건 신중한 희석 유용하다. 여러 샘플의 직접 비교를 위해 우리는 모든 샘플에 대해 동일한 희석 수준을 유지하는 것이 좋습니다. 감도 및 해상도의 영상을 제외한 모든 설정 ZetaView 분석 소프트웨어를 사용하여 나중에 변경 될 수있다.
<p class="저자는" 여기에 도입 된 시스템이 현재 가장 적합한 악기되는 것으로 판단하지만 "jove_content">, 그것은 유일하게 사용할 수있는 NTA 시스템이 아니다. 이전 보고서 번호 NTA 동일한 원리를 적용하지만, 일부는 다른 기능 (10)와 함께 다른 이동기구 설계를 제공하는 다른 시스템을 채용했다. 우리는 결과의 시료 처리 및 재현성에 관한 실용적인 측면이 엑소 평가를위한 방법 론적 순서를 선택하는 중앙 중요하다 있다고 생각합니다. 또한 이상 검출 시스템이 측정의 결과를 방해 할 수 따라 사용자 요인을 제거해야한다고 판단된다. 여기에 제시되는 엑소 좀 분석 접근법은 고도로 취급 용이성 기준을 충족. 또 다른 장점으로, 샘플의 분석 반자동 단시간에 결과를 생성하는 과정에서 빠르게 수행된다. 엑소 좀의 온라인 시각화 조지아에 분석기를 돕는다엑소 특성, 예를 들면, 총 농도의 인스턴트 아이디어.여기에 제시된 측정 기법에 매우 단순하지만 우아한 첨가 항체 표지 엑소 좀의 용도 및 검출기의 앞에 선행하는 필터를 이용하여 레이저 광 산란의 캡쳐이다. 이러한 방식의 엑소 소집단은 선택적 형광 염색법 기술적 접근 그들의 표면 항원 및 다른 중요한 생물학적 특성에 따라 구분 될 수있다.
우리 입자 추적 장비의 현재 버전의 하나의 단점은 매우 높은 민감도 수준에서 배경의 노이즈 아티팩트는 셀의 채널 벽에 기초하는, 본 될 수 있다는 사실이다. 현재의 시스템에 대한 기술적 인 해결책과 개선은 곧 제공 될 수있다. 채널 벽에 레이저 빛을 산란이 방법의 반사에 의해함으로써 증가, 감소 될 것이다 측정 된 신호 및 데이터 획득 및 검출 한계를 낮추는 정도.
엑소 격리를위한 현재 사용되는 프로토콜은 잘 설립인가 입자 추적기구 30 nm의 낮은 크기 분포와 매우 정밀한 해상도를 가지고 있지만, 검출 된 입자가 실제로 완전히 사실 엑소 좀 있다는 보장이 없다. 이러한 죽은 세포 조각 또는 큰 단백질 복합체와 같은 다른 입자는 또한 엑소 서스펜션에 존재하는 거짓 긍정적 인 신호가 발생할 수 있습니다. 이러한 "오염"을 전자 현미경 (EM)의 송신 또는 EM 주사 EM 이어도 배제 할 수있는 하나의 신뢰할 수있는 방법. 이전에 제안 된 표면 마커의 수는 tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9 등 (11)를 포함하여 관심의 증가 금액을 얻고있다하지만 불행하게도, 엑소 좀에 대한 일반 및 특정 마커는 지금까지 확인되지 않았다.
"> 무관 엑소 생물학, 특히 엑소 특정 마커에 관한 연구의 미래의 진보, 여기에 제시되는 프로토콜 단리 엑소 좀의 검출을위한 강력한 방법을 제공하는 것이다. 농도와 크기가 용이하게 소프트웨어 보조 식으로 결정될 수있다 간단한 패션. 선택적 형광 마커 또는 형광 결합 항체의 추가 가능성이 더 NTA의 제시 방법의 응용 가능성을 향상시킬 것입니다.Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referanslar
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