Protocolos para implementação de uma<em> Escherichia coli</em> Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

1. Extracto de células bruto Preparação Preparando extrato celular bruto durante três dias necessárias duas pessoas para conduzir de forma eficiente. O protocolo funcionalmente consiste em três partes: crescimento da cultura (passo 1.1 para o passo 1.11), lise celular (passo 1.12 para o passo 1.37), e extrair esclarecimento (passo 1,38 para o passo 1.52). Apresenta-se dividido em dias por conveniência. Extracto ideal pode produzir 0,75 mg / ml de deGFP de plasmídeo pBEST-OR2 OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), e tem uma concentração de extracto celular bruto entre 27-30 mg / ml de proteína. Quatro entanto , as características de extracto pode variar de lote para lote. A receita a seguir fornece o suficiente para cerca de 3.000 reações individuais (6 ml de extrato celular bruto). Se escalar para baixo, é recomendado o uso de nada menos do que 1/6 de valores aqui. Devido a limitações de tempo, ampliação não é recomendado. Dia 1 Preparar meios de cultura bacteriana, culplaca estrutura, mídia e suplementos, como descrito na Tabela 1. Veja material suplementar 1 para receitas. . Streak BL21-Rosetta2 estirpe de -80 ° C sobre uma placa de agar 2xYT + P + Cm e incubar durante pelo menos 15 horas a 37 ° C, ou até que as colónias são facilmente visíveis Nota: cloranfenicol (Cm) é utilizado para seleccionar um plasmídeo codificação tRNAs raros na cepa BL21-Rosetta2. Dia 2 Prepare tampões e suplementos, como descrito na Tabela 2. Veja material suplementar 1 para receitas. Preparar e esterilizar materiais necessários para o dia 3, incluindo: 6 x 4 frascos L de Erlenmeyer com tampa de alumínio (autoclavado), 4 x 1 L frascos de centrífuga estéreis, funil (autoclave), 100 g de 0,1 mm esferas de vidro (autoclavado), 2 agitar-bares (autoclavado), 1 L e 500 ml cilindro graduado (autoclavado), 2 x 1 copos L (autoclavados), 3 ml seringa com 18 agulhas G (estéreis), 2-3 flbóias de aveia, 2-3 10k MWCO cassetes de diálise (estéril), tinas. Prepare mini-cultura 1. Adicionar 4 ml de meio 2 x YT + P e 4 ul de Cm para um tubo de cultura de 12 ml estéril e pré-aquecer a 37 ° C durante 30 min. Inocular mini-cultura 1, com uma colônia do 2xYT + P + placa Cm agar. Incubar a 220 rpm, 37 ° C durante 8 horas. 7 horas e 30 minutos mais tarde, preparar mini-cultura 2. Adicionar 50 ml de meio 2 x YT + P e 50 ul de Cm para um estéril Erlenmeyer de 250 ml e pré-aquecer a 37 ° C durante 30 min. Inocular mini-cultura 2 com 100 ul de mini-cultura 1 e incuba-se a 220 rpm, 37 ° C durante 8 horas. Dia 3 Pesar quatro estéreis de 50 ml tubos Falcon vazios e massa registro na Tabela 3. Descontraia tubos Falcon no gelo, que serão posteriormente utilizados na etapa 1.18. 7 horas e 30 min após o passo 1.8, preparar meios de cultura bacteriana final. Usando um estéril 1 L cilindro graduado, transferência de 660 ml de meio 2xYT + P into cada um dos seis frascos de 4 L de Erlenmeyer e pré-aquecer a 37 ° C durante 30 minutos Nota:. 4 L ou maior matrás é recomendado para arejamento adequado. Adicionar 6,6 ml de mini-cultura 2 em cada Erlenmeyer 4 L. Incubar a 220 rpm, 37 ° C até a cultura atingir uma densidade óptica de 1,5-2,0 a 600 nm (o que corresponde a fase de crescimento semi-log). Verifique periodicamente OD com uma diluição de 1:10 da cultura para a exatidão Este passo não deve demorar mais do que 3 horas – 3 horas 45 min,. Rápido crescimento e coleta durante a fase mid-log é fundamental para a qualidade do extrato. Imediatamente após o crescimento, todas as culturas transferir uniformemente em quatro frascos de centrífuga de 1 L e centrifugar a 5000 g durante 12 min a 4 ° C para sedimentar as células bacterianas. Enquanto centrifugação, preparação completa tampão S30A, adicionando 4 ml de 1 M DTT a 2 L de previamente preparada S30A. Misture e manter tampão no gelo. Quando centrifugação estiver concluído, remova completamente o sobrenadante do passo 1,12 por decaNTING e secar as garrafas de centrífuga em uma toalha de papel estéril. Adicionar 200 mL de tampão de S30A a 4 ° C a cada um dos quatro frascos de centrífuga, e agitar os frascos vigorosamente até sedimento é solubilizado completamente sem grumos restantes. Centrifugar as quatro garrafas a 5.000 g durante 12 min a 4 ° C. Completamente remover o sobrenadante do passo anterior por decantação e secar as garrafas de centrífuga em uma toalha de papel estéril. Repita os passos de 1.15 e 1.16. Adicionar 40 ml de tampão S30A a 4 ° C a cada garrafa centrífuga. . Transfira cada bolinha e combinação S30A em um tubo Falcon refrigerados de 1,9) Nota: Este passo é transferir as bolinhas em um recipiente menor. Centrifugar os tubos Falcon a 2000 g durante 8 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante por decantação. Re-centrifuga os tubos Falcon a 2000 g durante 2 min a 4 ° C. Completamente remover o sobrenadante residual com uma pipeta. Mantenha no gelo. Pesar a fnossos tubos Falcon com pellet e massa registro na Tabela 3. Calcular massa sedimento, o volume de tampão necessário S30A, e massa de grânulos necessários com base nas fórmulas específicas na Tabela 3. Correto carga e talão batida do pellet é fundamental para fazer extrato de qualidade, e é o passo mais desafiador. Recomenda-se a rever o vídeo antes de tentar. A falha para evitar bolhas de ar e distribuir grânulos uniformemente irá resultar em extracto ineficiente. Adicionar a quantidade de tampão S30A calculados na Tabela 3 para cada tubo de Falcon, de vórtice até estar homogénea, e retornar para o gelo. Embora mantendo os outros tubos Falcon de gelo, adicionar grânulos de forma intermitente a um único tubo de Falcon em três alíquotas, cada uma usando 1/3 do total dos grânulos. Após a adição de cada aliquota de grânulos, em vórtice durante 30 seg. Coloque o tubo Falcon no gelo entre as etapas vórtice e depois vórtice final. Depois da última alíquota é adicionado, garantiresferas são distribuídas uniformemente. A pasta grossa deve ser formado. Prepare um 5 ml (volume) ponteira cortando o final usando uma lâmina de barbear estéril para criar uma abertura de 3-4 mm. Dial pipeta de 2 ml Nota: diferentes conjuntos de pipetas e pontas fornecer diferentes quantidades de sucção que pode não ser suficiente para puxar e libertar solução de células do grânulo de espessura, com uma ponta de pipeta de 1 ml com extremidade removido pode ser utilizado em substituição.. Colocar 20 tubos talão batendo no gelo. Verifique alta viscosidade da solução de células-talão usando pipeta modificado. Ele deve ser viscoso para o ponto de saída apenas a ponta da pipeta durante a ejecção. Se for muito viscoso, reajuste ponteira acordo com o passo 1,25. Se não for suficientemente viscosa, os grânulos podem ser adicionados em passos de (massa sedimento * 0,05), para um peso máximo (massa sedimento * 5.1). Após cada adição de grânulos, de vórtice durante 30 segundos e regressar ao gelo. Veja a Figura 3-A para uma demonstração de viscosidade. Remova a solução de células do grânulo de tubo Falcon utilizando pipeta modificado, e transferir para um tubo de batendo talão estéril, enchendo-o três quartos cheio com solução de células do grânulo. Gire extremamente brevemente (1s) em um balcão de mini-centrífuga para remover as bolhas de ar, sem redistribuição de contas. Ver Figuras 3b-d para imagens estáticas de carregamento tubo talão-de bater. Termine adicionando solução de células grânulo para formar um menisco côncavo. Adicione uma pequena gota de solução de células grânulo para o interior de uma tampa do tubo batendo talão, tomando cuidado para não impedir o lábio fora da tampa, caso contrário, o tubo batendo talão não vai fechar sufficientl y. Toque a tampa sobre uma superfície plana e verifique se não há bolhas de ar na parte inferior da tampa. Tapar o tubo batendo grânulo com a tampa batendo talão do passo anterior. Mão para assistente de talão de bater. Se feito corretamente, a tampa deve ser hermeticamente fechado, sem bolhas de ar shoulestaria visível, e pouco (se houver) solução de células talão deve transbordar. Refazer o processo de carregamento, se as bolhas de ar são visíveis ou a tampa não fechar totalmente. Vortex tubo Falcon de passo 1,24 com a solução de células talão restante para assegurar uma distribuição uniforme de contas. Repita os passos de 1,28-1,31 até tubo Falcon está vazia e, depois, repetir os passos 1,24-1,31 para cada tubo Falcon adicional. Conduta passos 1,33-1,38 simultaneamente. Já assistente take cheio de tubos de 1,31 batendo talão e colocar no gelo. Uma vez que dois tubos batendo talão preenchidos foram recolhidos e foram no gelo por pelo menos um minuto, comece talão de bater. Bata um tubo de 30 segundos a 46 rpm. Coloque de cabeça para baixo no gelo por 30 segundos, enquanto batendo o outro tubo. Repita o passo anterior de tal forma que cada tubo batendo talão preenchido foi vencer por 1 min total. Repita os passos de 1,33-1,35 até 8 tubos cheios talão batendo (ou a quantidade máxima da centrífuga pode segurar) have foi processado. Em seguida, constroem aparelho de filtro a partir de 15 ml Falcon (Figura 3e). Adicionar um novo cap-batendo grânulo,-parte plana virada para cima, para o fundo de um 15 ml Falcon. Em seguida, retire a tampa do tubo batendo talão processados ​​e imprensa coluna micro-cromatografia firmemente extremidade do tubo batendo talão processada até que esteja completamente selado. Pressão em final de eluição de coluna micro-cromatografia, e coloque coluna micro-cromatografia de eluição acabar para baixo, em vazio tubo talão beading. Coloque este complexo em 15 ml Falcon. Repita o procedimento para todos os 8 tubos batendo talão cheias; manter em gelo quando completa. Centrífuga 8 aparelhos de filtro, o tubo Falcon destapado, a 6.000 g durante 5 min a 4 ° C para separar o extracto de sedimento e de grânulos. Verifique cada tubo talão espancamento produziu extrato viável. Extracto propriamente bater não será turva, e o sedimento terá duas camadas distintas. Descarte todos os tubos turvas, e transferir o sobrenadante de tubos não turvas i1,75 ml tubos de micro-centrífuga nto individuais, tendo tão pouco pellet possível. Mantenha no gelo até que todos os tubos de bater talão foram processadas. Veja a Figura 3-F comparar um tubo talão espancamento corretamente vs incorretamente processados. Tubos de centrífuga de micro-centrífuga a partir do passo anterior, em 12,000 g durante 10 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante em tubos talão batendo vazio usando uma pipeta, consolidando 500 mL em um novo tubo batendo talão livre de pelota. Incubar passo anterior, equipados com tampas de bater talão removidos, a 220 rpm, 37 ° C durante 80 min. Este passo digere restantes ácidos nucleicos utilizando exonucleases endógenos libertados durante o processo de perolização-grânulo, e pode ser feito através do tubo de pé-de bater grânulo em um tubo de cultura de tecidos. Preparar materiais de diálise. Preparação tampão completa S30B por adição de 2 ml de 1 M DTT a 2 L de previamente preparada S30B. Misture e adicione 900 ml em cada um dos dois ªerile 1 L copos. Adicionar agitador magnético estéril em cada copo, manter a 4 ° C. Depois do passo 1,41, extrato deve olhar turvo. Consolidar extracto em 1,5 ml de alíquotas de 1,75 ml em tubos de micro-centrífuga, e centrifugar a 12000 g durante 10 min a 4 ° C. Usando uma pipeta, consolidar sobrenadante livre de pellet em 15 ml tubos Falcon no gelo, e misture bem por tampar o tubo e inversora. Economize 10 ml de sobrenadante no gelo para a etapa 1.47. Determinar a quantidade total de extracto produzido, e hidratar o número necessário de 10k cassetes de diálise de MWCO submergindo em S30B durante 2 minutos, assumindo que 2,5 ml de extracto por cassete. Coloque cassetes com 2,5 ml do extrato. Cada proveta pode levar até 2 cassetes; diálise, agitação, a 4 ° C durante 3 horas Nota: carga parcial de cassetes é aceitável.. Dialisadora aumenta o rendimento da produção da proteína. Durante o passo anterior, caracterizar a proteína extractoconcentração com um ensaio de Bradford, utilizando extrato salvou na etapa 1.44. Veja material suplementar 2 para mais detalhes. Após a diálise é completa, extrato de alíquota de 1,5 ml em 1,75 ml tubos de micro-centrífuga. Centrifugar a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. Um sedimento vai formar-se no fundo do tubo. Consolidar claro sobrenadante do passo anterior por pipetagem em um tubo Falcon de 15 ml no gelo. Homogeneizar por inversão de 5-10x. Com base na concentração determinada por Bradford no passo 1.47, determinar a quantidade de extracto individuais Alíquota em tubos de 1,75 ml. Cada tubo indivíduo deve ter um volume de 810-900 mg de proteína total. Extrair deve ter uma concentração de proteína total maior do que 27 mg / ml. Esta etapa requer assistência para realizar expediente Nota:. Extrato alíquota abaixo de 30 mg / ml em 30 mL alíquotas e escala se a concentração é maior, por exemplo, o extrato de alíquota de 28 mg / ml por 30 mL, e extrato de alíquota em 32mg / ml por 28,1 ul. Extrato alíquota seguinte passo 1,50, tomando cuidado para evitar bolhas. Extracto de inflamação por congelação em azoto líquido Nota:. Alíquotas com bolhas pode ser removido por centrifugação a 10.000 xg durante 30 seg a 4 ° C. Remova os tubos de nitrogênio líquido usando uma peneira e armazenar imediatamente a -80 ° C. Segurança: Usar óculos de proteção; as tampas de tubos de extrato pode sair devido à diferença de temperatura entre nitrogênio líquido e temperatura ambiente. 2. Amino Acid Solution Preparação Solução de aminoácidos devem ser preparados em massa. A receita a seguir utiliza um kit completo de RTS Aminoácidos Sampler, fornecendo o suficiente para aproximadamente 11.000 reações individuais. Se dimensionamento para baixo, é recomendável usar não menos do que metade de um kit. Cada aminoácido no estoque é fornecido a 1,5 ml, 168 mM, excepto para a leucina na 140 mM. A composição final de solução de aminoácidos é:leucina, 5 mM, todos os outros aminoácidos, 6 mM. Esta é a concentração de trabalho de 4x. Remove todos os 20 aminoácidos a partir de -20 ° C e descongelamento à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, vortex até aminoácidos dissolver, incubando a 37 ° C, se necessário. Depois de aminoácidos são dissolvidos, colocar todos os aminoácidos excepto em gelo para Asn, Phe, e Cys, que são mantidas à temperatura ambiente. Cys pode não se dissolvem totalmente. Em gelo, adicionar 12 ml de água estéril para um tubo Falcon de 50 ml estéril. Adicionar 1,5 ml de cada um dos aminoácidos, na seguinte ordem, tendo o cuidado de vortex do tubo Falcon após cada adição e para manter a solução em gelo: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gli, His, lie, Lys, Met, Fen, Pro, Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys pode ser adicionado como uma suspensão. Depois disso, vortex até que a solução é relativamente claro, incubando a 37 ° C, se necessário. Cys pode não se dissolvem totalmente. Solução de aminoácidos Alíquota em 50 tubos de26 mL cada no gelo. Alíquota o resto em 500 mL por tubo no gelo. Os 26 mL alíquotas serão utilizadas para a calibração de extracto, enquanto as alíquotas de 500 uL irá ser utilizado para a preparação de tampão. Enquanto alíquotas, vórtice do estoque principal frequentemente para evitar a distribuição desigual de suspensão. Alíquotas do Flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Segurança: Usar óculos de proteção; as tampas de tubos de extrato pode sair devido à diferença de temperatura entre nitrogênio líquido e temperatura ambiente. Opcional: Realizar um ensaio da atividade de solução de aminoácidos recém-feita contra soluções de aminoácidos feitas anteriormente. 3. Preparação de Solução de energia Solução de energia é utilizada tanto para a calibragem de extracto bruto de células e para a criação de tampão, e devem ser preparados em grandes quantidades. A receita a seguir fornece o suficiente para cerca de 10 mil reações individuais. Se escalar para baixo, é recomeNDED usar nada menos do que 1/24 dos valores aqui apresentados. Como a solução de energia é um custo monetário significativo, os usuários primeira vez pode querer preparar em escala 1/24. A composição final de solução de energia é: HEPES 700 mM pH 8, 21 mM de ATP, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, 12,6 mM de UTP, ARNt 2,8 mg / ml, 3,64 mM de CoA, NAD 4,62 mM, AMPc 10,5 mM, ácido folínico 0,95 mM, espermidina 14 mM, 3-PGA 420 mM. Esta é a concentração de trabalho de 14x. Se desejado, cada artigo individual na Tabela 4 pode ser armazenada a -80 ° C para uso posterior. Remove todos os produtos químicos na Tabela 4 a partir de -80 ° C, -20 ° C, ou 4 ° C até à temperatura ambiente durante 30 min. Preparar soluções de reserva, tal como descrito na Tabela 4. Veja material suplementar 1 para receitas. Coloque todas as soluções no gelo após a preparação. Num tubo Falcon de 15 ml, adicionar, na seguinte ordem, tendo o cuidado de vortex do tubo Falcon após cada adição e para manter as soluções on gelo: 3,6 ml de 2 M de HEPES, 144 mL de água, 1,39 ml de mistura de nucleótidos, 576 ul de 50 mg / ml de ARNt, 576 ul mM de CoA-65, 276 ul de 175 mM de NAD, 170 ul de 650 mM de cAMP, 288 ul 33,9 ácido folínico mM , 144 ul de 1 M espermidina, e 3,09 ml de 1,4 M de 3-PGA. Solução Energia Alíquota em 50 tubos de 7 mL cada no gelo. Alíquota o resto em 150 mL por tubo no gelo. Os 7 mL alíquotas serão utilizadas para a calibração de extracto, enquanto os 150 mL alíquotas será utilizado para a preparação de tampão. Enquanto alíquotas, vórtice do estoque principal frequentemente. Alíquotas do Flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Segurança: Usar óculos de proteção; as tampas de tubos de extrato pode sair devido à diferença de temperatura entre nitrogênio líquido e temperatura ambiente. Opcional: Realizar um ensaio de recém-feitos Solution Energia contra Energy Solutions feitas anteriormente atividade. 4. Tampão de Preparação Buffer Preparação exige a realização de celular extrato bruto de Preparação de Aminoácidos Solução Preparação e Energia Solução Preparação. Cada buffer é exclusivo para um lote de extrato celular bruto. Mg-glutamato, K-glutamato e DTT (nessa ordem) são otimizados nesta seção para produzir reações com níveis máximos de expressão. O protocolo a seguir utiliza um modelo de pré-escrita, TXTL_e (modelo) _calibration_JoVE.xlsx (Material Suplementar 3), para calibrar extrato celular bruto pré-preparados e preparar buffer. No entanto, também se pode calibrar extrato celular bruto e preparar tampão sem o modelo por meio da otimização Mg-glutamato, K-glutamato e DTT manualmente e configurar o buffer de tal forma que, juntamente com o extrato, é 75% de um volume total de reacção. Se a calibragem manualmente, condições de final de reacção pode ser encontrada na etapa 5. Preencha o formulário "Dados Gerais". Descongelar em gelo 100 mM de Mg-glutamato (4 ° C), 3 H K-glutamato (4 ° C), 6Solução mM Aminoácidos (26 mL, -80 ° C), Solução de energia (7 mL, -80 ° C), DTT 100 mM (-20 ° C), o DNA de controlo positivo (-20 ° C), 40% de PEG- . 8,000 (4 ° C), extracto celular bruto (-80 ° C), e água (4 ° C) Nota: O uso de 1 nM de concentração de trabalho pBEST-OR2 OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmídeo 40019) para o controlo positivo (excitação 485 nm, emissão 525 nm), ou outra referência que produz o sinal de alta intensidade 4. Prepare sete 10,5 reações ul, testando uma série de 4-10 mM Mg-glutamato adicional, por alíquotas definidas quantidades de estoque Mg-glutamato em tubos de micro-centrífuga individuais. Nota: Embora 10,5 ul reacções são inicialmente preparado, o final da reacção é de 10 uL. Prepare a mistura principal conforme indicado no molde sob a "calibração Mg-glutamato," a adição de um adicional de 80 mM de K-glutamato. Manter em gelo e vórtex após a adição de cada item Nota:. Os valores aqui apresentados e no modelo sãopara além das quantidades de Mg-glutamato, K-glutamato, e DTT presente no tampão usado para fazer S30B extracto celular bruto. Adicione a mistura de mestre para amostras contendo Mg-glutamato e preparar reações. Veja os passos 5,10-5,13 para instruções detalhadas. Executar reacção a 29 ° C, quer numa incubadora ou num leitor de placas. . Determinar concentração de Mg-glutamato ideal por nível no final de expressão e taxa máxima de expressão da proteína (Figura 4-A) Nota: Tempos de Execução variar de acordo com experiência, mas geralmente duram menos de 8 horas. Repita os passos 4.2 a 4.7 para o K-glutamato em "K-glutamato de calibração", estabelecendo os níveis de Mg-glutamato às encontradas no passo 4.7. Repita os passos 4.2 a 4.7 para a TDT em "calibração TDT", que fixa os teores Mg-glutamato aos encontrados no passo 4.7 e os níveis de K-glutamato aos encontrados no passo 4.8 Nota:. Descobrimos que acrescentou que a TDT não afecta significativamente o final de os níveis de expressão. UsoOs valores encontrados na calibração sob "a composição do tampão" para determinar a composição de tampão a ser preparado. Com base na quantidade de extrato celular bruto produzido, uma receita mistura principal é produzido por um valor conjunto de buffers. Descongele alíquotas conforme listado na receita mestre mix no gelo. Uma vez descongelada, a preparação da mistura principal, mantendo em gelo e centrifugação, depois da adição de cada item. Alíquota por montante declarado em "composição de Buffer". Tubos de tampão Flash-congelamento em nitrogênio líquido. Enquanto alíquotas, vórtice o estoque principal freqüência. Remova os tubos de nitrogênio líquido usando uma peneira e armazenar imediatamente a -80 ° C. Segurança: Usar óculos de proteção; as tampas de tubos de extrato pode sair devido à diferença de temperatura entre nitrogênio líquido e temperatura ambiente. 5. Execução Experimental de uma Reação TX-TL Condições de reação finais são: 8,9-9,9 mg / ml proteem (a partir de extracto em bruto), 4,5 mM 10,5 mM-Mg-glutamato, 40-160 mM de K-glutamato, DTT 0,33-3,33 mM, 1,5 mM de cada aminoácido, excepto leucina, leucina 1,25 mM, HEPES 50 mM, ATP 1,5 mM e GTP, CTP e UTP 0,9 mM, 0,2 mg / ml de ARNt, CoA 0,26 mM, 0,33 mM de NAD, cAMP 0,75 mM, 0,068 mM de ácido folínico, 1 mM de espermidina, 30 mM de 3-PGA, 2% de PEG-8000. uma base TX -TL reacção tem três partes (tubos): extracto celular bruto, tampão, e ADN. A proporção é: tampão de 75% e extrato, 25% do DNA As reações podem variar de volume, e nós usamos 10 ml por convenção para minimizar o volume de reação e permitir que funciona em uma placa de 384 poços.. Volumes maiores requerem agitação para a oxigenação adequada. O protocolo a seguir utiliza um modelo de pré-escrita, TXTL_JoVE.xlsx (Material Suplementar 4), para realizar uma reação de 10 mL. Itens em roxo indicam valores-de entrada do usuário, e os itens em azul indicam reagentes adicionais para adicionar à reação. No entanto, também se pode realizar uma sagacidade reaçãohout o modelo, seguindo condições de reação descritas acima. Preencha o formulário "Dados Gerais". Em "Master Mix Preparação", inserir o valor percentual de extrato a partir do passo 4.1 na caixa roxa. Projete seu experimento in silico usando o "Master Mix Preparação" (linhas 10-17) e "DNA Preparação" (linhas 19-50) seções. Geralmente, as constantes podem ser colocados na seção "Master Mix Preparação", enquanto que as variáveis ​​podem ser colocados na seção "Preparação de DNA". Minimizar amostras por experimento para evitar a evaporação da amostra e viés experimental hora de início. Veja a Figura 6 para uma configuração de amostra. Em "Master Mix Preparação", adicionar os reagentes, tais como indutores ou proteínas, que vão em todas as amostras com uma concentração constante. Começando com a linha 14, preencha as áreas sombreadas azuis, mantendo um reagente para cada linha. Unidades são proporções relativas. Em "Preparação de DNA", adicionar DNA que será específi amostraic. IDs amostra # 1 e # 2 correspondem aos controles positivos e negativos, respectivamente. IDs de amostra # 3 e acima são repetições (de 10 reacções ul) pelo usuário modificável para DNA, a concentração de ações em ng / mL, comprimento em pares de bases, concentração final desejada em nM, e. A quantidade de DNA de ações para atingir a concentração final desejada é calculado automaticamente. . Total entre os montantes de linha a 10,5 * n, onde n é o número de repetições Nota: Embora o volume final da reacção é de 10 uL, os cálculos assumem um volume total de 10,5 mL por reacção, para ter em conta o volume perdido durante a pipetagem. Em "Preparação de DNA", adicionar reagentes ou DNA adicional que será específico para amostra colunas azuis. As concentrações da ADN em nm pode ser calculado de acordo com "Preparação de ADN", enquanto que os reagentes específicos de exemplo exigem o cálculo manual com base num volume de reacção total de 10,5 * n. Os volumes introduzidos são subtraídos para fora do volume de água da mesma linha. Remover numbe necessáriar de tubos de tampão, o extracto celular em bruto, e o controlo positivo em "tubos para descongelar," a partir de -20 ° C ou -80 ° C e descongelar em gelo. Preparar as amostras de DNA. Para cada amostra ID, alíquota o DNA indicada, água e itens fornecidos pelo usuário por seção "Preparação de DNA" em um tubo de micro-centrífuga, à temperatura ambiente Nota:. Para evitar a perda de amostra, recentemente pipetas e baixo-stick calibrado pontas para pipetas e tubos de micro-centrífuga são recomendados. Quando tubos da etapa 5.7 ​​são descongelados, prepare a mistura de mestre-tampão, extrato, e todos os itens fornecidos pelo usuário globais com base nas caixas-shaded laranja, mantendo no gelo e centrifugação, após a adição de cada item Nota:. Extract é extremamente viscoso. Alíquotas com bolhas pode ser removido por centrifugação a 10.000 xg durante 30 seg a 4 ° C. Adicione a quantidade de mistura principal indicado nas células laranja em "DNA Preparação" (coluna O) para cada amostra de DNA, e mantê-la em temperatura ambienteture. Trate isso como o tempo de início de reação. Vortex de cada amostra, e centrifugar a 10000 xg durante 30 segundos à temperatura ambiente para fazer descer qualquer amostra residual e para reduzir as bolhas. Se a condução da reacção em tubos de micro-centrífuga, incubar directamente a 29 ° C. . Caso contrário, pipeta 10 ul de amostra numa placa de 384 poços Nota: As reacções em volumes maiores do que 10 mL pode requerer agitação para oxigenação. Centrifugar a placa de 4.000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente para reduzir qualquer amostra residual e para reduzir as bolhas. Selar placa depois para evitar a evaporação. Execute reação a 29 ° C. Nota: Runtimes variam de acordo com experiência, mas geralmente duram menos de 8 horas.