Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Hay una interacción dinámica y co-evolución entre las bacterias y los anfitriones en los que residen. Las bacterias han evolucionado orgánulos de adherencia, sistemas de secreción, y / o la capacidad de producir toxinas que permiten su infección productiva de fagocítica huésped y células no fagocíticas. Las bacterias también deben enfrentarse con el reconocimiento y la actividad antimicrobiana del sistema inmune del huésped. El sistema inmune del huésped se compone de componentes innatos y adaptativos, incluyendo barreras físicas y químicas, las células inmunes, el sistema del complemento, y otros componentes de la inmunidad humoral. Mientras que muchas bacterias son susceptibles a la muerte y despeje de la respuesta inmune del huésped de varias capas, algunas bacterias patógenas y oportunistas han desarrollado mecanismos para infectar una variedad de células huésped y subvertir despeje de la respuesta inmune del huésped ^1. Neisseria gonorrhoeae es un ejemplo de un patógeno bacteriano que está altamente adaptado para persistir en su huésped humano. N. gonorrhoeae coloniza fácilmente las superficies luminales de las células epiteliales de la mucosa del tracto urogenital, la faringe, la conjuntiva, y el recto. Colonización desencadena la abundante reclutamiento de neutrófilos en las mucosas. Los neutrófilos son fagocitos profesionales que poseen una variedad de procesos antimicrobianos para matar los microorganismos, sin embargo, N. gonorrhoeae es capaz de sobrevivir en la presencia de neutrófilos ^2-5. Entender cómo los patógenos bacterianos como N. gonorrhoeae subvertir, suprimir, y secuestrar la respuesta inmune a sobrevivir en última instancia, en entornos host normalmente hostiles es crucial para el desarrollo de nuevas terapias para combatir las enfermedades infecciosas.

Los protocolos experimentales a menudo utilizados para investigar la supervivencia bacteriana en las células huésped incluyen ensayos de recuento de colonias, ensayos de protección de gentamicina, y microscopía electrónica. En los ensayos de recuento de colonias, una población de células infectadas se lisa (por ejemplo, con un detergente para quich las bacterias son resistentes) para liberar las bacterias. Los lisados ​​se diluyeron y se extendieron en placas sobre medios con agar, y las unidades formadoras de colonias en los lisados ​​se enumeran para cada punto de tiempo y / o condición experimental. Este enfoque informa de la viabilidad de toda la población bacteriana, pero no es capaz de diferenciar entre intracelular y extracelular de supervivencia. Una variación en el ensayo de recuento de colonias, el ensayo de protección de gentamicina, mide específicamente la supervivencia bacteriana intracelular, basado en la incapacidad de los antibióticos gentamicina para cruzar la membrana plasmática eucariota ^6. Sin embargo, este ensayo depende de las bacterias que son susceptibles a la muerte por la gentamicina (u otro antibiótico que es similar eucariota membrana impermeable a) y la incapacidad del antibiótico para tener acceso a las bacterias internos. Por lo tanto, un ensayo de protección de la gentamicina puede no ser eficaz para el examen de todas las especies bacterianas o al examinar la supervivencia bacteriana en altamentecélulas de pinocitosis, tales como los neutrófilos. Ninguno de estos enfoques revela la localización subcelular u otro comportamiento de las bacterias individuales (por ejemplo, si las bacterias forman agregados o microcolonias que se comportan de manera diferente a partir de células bacterianas individuales). Otro enfoque utilizado con frecuencia para examinar la viabilidad de las bacterias externas e internas individuales es-sección delgada microscopía electrónica de transmisión (TEM). Este enfoque es ventajoso porque puede proporcionar información acerca de la ubicación de las bacterias en las células huésped (por ejemplo fagosoma, citoplasma, autofagosoma), que se puede investigarse más a fondo mediante microscopía inmunoelectrónica con anticuerpos de oro acoplado contra marcadores subcelulares. Sin embargo, la microscopía de electrones no es especialmente sensible a la evaluación de la viabilidad bacteriana. Cuando las secciones embebidas son teñidas con acetato de uranilo, citrato de plomo, u otros reactivos densos en electrones y imágenes de microscopía de electrones, las bacterias electrón-densos se consideran viables y electrónicostron-lucent inviable ^7,8. Sin embargo, esta hipótesis sobrevalora la viabilidad bacteriana, ya que sólo las bacterias muertas con membranas gravemente perturbado y desprovistos de citoplasma aparece electrón-Lucent. Además, algunas especies bacterianas pueden mostrar una gama de densidades de electrones, dependiendo de su etapa de crecimiento, lo que hace difícil determinar la viabilidad.

Como una alternativa o además de estos métodos ampliamente utilizados, aquí proporcionamos protocolos y fundamento para el uso de colorantes fluorescentes que indican la viabilidad bacteriana para evaluar la supervivencia de las bacterias unidas a y internalizados por las células huésped. Para identificar bacterias extracelulares, las células infectadas se primera expuestos a un reactivo fluorescente, tal como una lectina o anticuerpo de bacterias específicas. Las células infectadas se permeabilizaron y luego expuestos a colorantes específicos de ADN que son diferencialmente accesible a las bacterias con intacta vs membranas degradadas, como un sustituto para la viabilidad bacteriana. En la primera protocol, la membrana permeable SYTO9 tintura identifica la población bacteriana total, mientras que el yoduro de propidio sólo se puede acceder a esas bacterias que han puesto en peligro las membranas y por lo tanto se considera no viable. Yoduro de propidio y SYTO9 se han utilizado para evaluar la viabilidad bacteriana en las biopelículas, discriminar patógena de bacterias no patógenas, y enumerar bacterias transmitidas por el agua viables ^9-12. En el segundo protocolo, 4 ', 6' diamidino-2-fenilindol (DAPI) identifica bacterias totales, mientras SYTOX verde es sólo accesible a la población no viable. Estos pares de colorantes de viabilidad se pueden combinar con inmunofluorescencia para determinar la ubicación de cada bacteria en relación con una proteína de interés, por ejemplo, para definir la localización subcelular bacteriana. El uso de estos ensayos proporciona una visión clave en las interacciones que resultan en la destrucción bacteriana o la supervivencia durante la infección de las células huésped. Los protocolos descritos en este artículo se utilizaron para evaluar la viabilidad deN. gonorrhoeae que se une a y dentro de los neutrófilos humanos primarios, incluyendo en diferentes poblaciones de fagosomas de neutrófilos ^5,13,14. Sin embargo, estos protocolos pueden ser aplicados para evaluar la viabilidad de las bacterias Gram-positivas y gram-negativas en fagocitos profesionales, los fagocitos no profesionales, y protozoos ^15-24.