Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d'adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l'hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l'activité antimicrobienne du système immunitaire de l'hôte. Le système immunitaire de l'hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d'autres composants de l'immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l'hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d'infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l'hôte immunisé réponse ^1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d'un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles ^5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d'accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses.

Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d'agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d'une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l'ensemble de la population bactérienne, mais n'est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l'essai de comptage de colonies, l'essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l'incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote ^6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l'incapacité de l'antibiotique d'avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l'examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l'examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu'elle peut fournir des informations concernant l'emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d'or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n'est pas particulièrement sensible à l'évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l'acétate d'uranyle, le citrate de plomb, ou d'autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable ^7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d'électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité.

Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l'utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d'évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d'abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l'ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l'iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L'iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d'origine hydrique viables ^9-12. Dans le second protocole, 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l'emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d'intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L'utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l'infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l'intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles ^5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des ^{15 à 24.}