مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض الانتهازية وآليات لتصيب مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة وتخريب التخليص من قبل المضيف المناعي استجابة ^1. النيسرية البنية هو مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية التي يتم تكييفها للغاية أن تستمر في المضيف الإنسان. N. البنية يستعمر بسهولة السطوح اللمعية من الخلايا الظهارية المخاطية من الجهاز البولي التناسلي والبلعوم والملتحمة، والمستقيم. الاستعمار يتسبب في التوظيف وفيرة من العدلات في مواقع المخاطية. العدلات هي البالعات المهنية التي تمتلك مجموعة متنوعة من العمليات المضادة للجراثيم لقتل الكائنات الحية الدقيقة، ومع ذلك، N. البنية غير قادرة على البقاء في وجود العدلات ^2-5. فهم كيفية مسببات الأمراض البكتيرية مثل N. البنية تخريب، وقمع، وخطف الاستجابة المناعية البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في بيئات معادية المضيف عادة هو أمر حاسم في تطوير علاجات جديدة لمكافحة الأمراض المعدية.

البروتوكولات التجريبية غالبا ما تستخدم للتحقيق بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة تشمل فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. في فحوصات العد مستعمرة، ويبلغ عدد سكانها هي lysed الخلايا المصابة (على سبيل المثال، مع المنظفات لذوي الخوذات البيضاءمعنوى البكتيريا مقاومة) لتحرير البكتيريا. وتضعف لست] ومطلي على وسائل الاعلام القائمة على أجار، ويتم تعداد الوحدات المكونة للمستعمرة في لست] لكل نقطة زمنية و / أو حالة تجريبية. هذا النهج تقارير الجدوى من السكان البكتيرية بأكمله ولكن غير قادر على التفريق بين الخلايا والبقاء على قيد الحياة خارج الخلية. وهناك تباين في مقايسة العد مستعمرة، مقايسة حماية الجنتاميسين، يقيس على وجه التحديد بقاء البكتيريا داخل الخلايا، استنادا إلى عدم قدرة جنتاميسين مضاد حيوي لعبور حقيقية النواة غشاء البلازما ^6. ومع ذلك، هذا الاختبار يعتمد على البكتيريا كونها عرضة للقتل من قبل جنتاميسين (أو مضاد حيوي آخر هو بالمثل حقيقية النواة غشاء impermeant) وعدم قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى البكتيريا الداخلية. وبالتالي، مقايسة حماية الجنتاميسين قد لا تكون فعالة لفحص كل أنواع البكتيريا أو عند النظر في البقاء على قيد الحياة البكتيرية للغايةخلايا pinocytic مثل العدلات. لم يكن أي من هذه الطرق يكشف توطين التحت خلوية أو أي سلوك آخر من البكتيريا الفردية (على سبيل المثال إذا كانت البكتيريا تشكيل المجاميع أو microcolonies أن تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البكتيرية الفردية). آخر النهج كثيرا ما تستخدم لدراسة الجدوى من البكتيريا الخارجية والداخلية الفردية رقيقة المقطع انتقال الإلكترون المجهري (TEM). هذا النهج هو مفيد من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات بشأن مكان وجود البكتيريا في الخلايا المضيفة (مثل يبلوع، السيتوبلازم، جسيم بلعمي ذاتي)، والتي يمكن أن تحقق مزيدا من immunoelectron المجهري مع الأجسام المضادة إلى جانب الذهب ضد علامات التحت خلوية. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني ليست حساسة ولا سيما في تقييم الجدوى البكتيرية. عندما يتم ملطخة أقسام جزءا لا يتجزأ مع خلات اليورانيل، سترات الرصاص، أو غيرها من الكواشف الإلكترون الكثيفة والتقط بواسطة المجهر الإلكتروني، وتعتبر البكتيريا الإلكترون كثيفة قابلة للحياة وكهربائيTRON-وسنت غير قابل للحياة ^7،8. ولكن هذا الافتراض يغالي بقاء البكتيرية، ومنذ تلك البكتيريا الميتة فقط مع الأغشية تعطلت بشدة وتخلو من السيتوبلازم تظهر الإلكترون لوسنت. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض الأنواع البكتيرية عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات اعتمادا على مرحلة نموها، مما يجعل من الصعب تحديد الجدوى.

كبديل أو بالإضافة إلى هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع، وهنا نقدم بروتوكولات والأساس المنطقي لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تشير إلى بقاء البكتيرية لتقييم بقاء البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. لتحديد البكتيريا خارج الخلية يتم، أولا، تتعرض الخلايا المصابة إلى كاشف الفلورسنت، مثل كتين أو الأجسام المضادة البكتيريا محددة. ثم يتم permeabilized الخلايا المصابة والمعرضة للالأصباغ الحمض النووي المحددة التي يمكن الوصول إليها بشكل مختلف للبكتيريا مع الأغشية سليمة مقابل المتدهورة، كبديل للبقاء البكتيرية. في ع الأولrotocol، يحدد غشاء منفذ صبغ SYTO9 مجموع السكان البكتيرية، في حين يوديد propidium هو فقط للوصول الى تلك البكتيريا التي أثرت سلبا الأغشية، وبالتالي فهي تعتبر غير قابل للحياة. وقد استخدمت يوديد propidium وSYTO9 لتقييم الجدوى البكتيرية في الأغشية الحيوية، تميز الممرضة من بكتيريا غير إمراضية، وتعداد البكتيريا التي تنتقل عن طريق المياه قابلة للحياة ^9-12. في البروتوكول الثاني، 4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) يحدد مجموع البكتيريا، في حين SYTOX الأخضر هو فقط للوصول الى السكان غير قابل للحياة. هذه الأزواج بقاء الصبغة يمكن الجمع بين المناعي لتحديد موقع كل البكتيريا في ما يتعلق بروتين من الفائدة، على سبيل المثال لتعريف توطين التحت خلوية البكتيرية. استخدام هذه المقايسات يقدم رؤية المفتاح في التفاعلات التي تؤدي إلى قتل البكتيريا أو البقاء على قيد الحياة خلال العدوى من الخلايا المضيفة. تم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لتقييم جدوىN. البنية التي يتم تركيبها داخل والعدلات الإنسان الأساسية، بما في ذلك مجموعات مختلفة من phagosomes العدلة ^5،13،14. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم الجدوى من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام في البالعات المهنية، البالعات غير المهنية، والبروتوزوا ^15-24.