Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em> Escherichia coli</em> Y<em> Vibrio cholerae</em

Hemos llevado a cabo una serie de transformaciones con E. coli y V. cholerae para comparar la eficiencia de transformación de nuestra metodología rápida con una adaptación del método (tradicional) originalmente descrito por Dower et al. 2 para la preparación de bacterias electrocompetentes. Para llevar a cabo la preparación tradicional de las células competentes, 500 ml de LB en un matraz Erlenmeyer de 2 L-se inocularon con 500 l cultivo de una noche de E. coli DH5a o V. cholerae O395, se incubaron en un agitador orbital (215 rpm a 37 ° C) y se recogieron a una DO de 600 de entre 0,5-1,0. El matraz se enfrió en hielo y los cultivos se centrifugó en un rotor enfriado previamente a 4.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron cuidadosamente en 500 ml de hielo frío-2 mM CaCl 2 para V. cholerae y ddH2O para E. coli, y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. Rondas posteriores de una resuspensiónd centrifugación se llevaron a cabo en la disminución de los volúmenes de 200 y 100 ml volúmenes asegurándose de que la cultura se mantuvo refrigerada a 4 ° C. Por último, una resuspensión y centrifugación en un volumen de 10 ml se llevó a cabo con 10% de glicerol. El sedimento final se resuspendió en 2 ml de 10% de glicerol y 40 ml de alícuotas se congelaron a -80 ° C y ya no se almacena de una semana antes de la electroporación. Las condiciones de electroporación incluida la configuración de impulsos y el tamaño de la cubeta fueron idénticas para ambas especies bacterianas en todas las electroporaciones independientemente del método de preparación de células competentes. La única diferencia fue que se llevó a cabo los lavados en frío ddH 2 O de E. coli y frío mM CaCl 2 para V. 2 . cholerae Tabla 1 muestra los resultados de bacterias transformadas por electroporación idénticamente pero se hacen competentes ya sea con el protocolo rápido o con el método tradicional. Empleamos O395 cepa DH5a y tan comúnutilizados Ly, cepas representativas de V. cholerae y E. coli, respectivamente; resultados similares se pueden obtener con otras cepas de la misma especie (aunque no todos de una sola cepa ha sido probado) y es probable que adaptarse a otras bacterias Gram-negativas y probablemente más allá. Para asegurar que el número de células iguales estaban presentes en cada lote pulsada, bacterias electrocompetentes generados utilizando el método rápido se agruparon en el ordeño, mezclan, mantienen suspendidas homogéneamente, y tomaron alícuotas en 40 volúmenes mu l, poco antes de la electroporación. Bacterias Electrocompetent generadas utilizan el método tradicional fueron tratados de manera similar antes de la congelación en 40 ml de alícuotas. Después de la entrega del pulso, cada lote de 40 l de bacterias por electroporación se suspendió en 400 l de LB y se diluyeron en serie 1:10. Cien microlitros de cada dilución se colocaron en placas en agar LB en presencia de 100 mg / ml de ampicilina y se extendió usando un esparcidor de vidrio estéril de célulasy se incubaron a 37 ° C durante la noche. Para cuantificar el número total de bacterias empleadas en cada transformación, 40 volúmenes mu l de bacterias electrocompetentes de cada lote preparado se diluyeron en serie, y se sembraron en agar LB sin antibióticos de forma idéntica en paralelo. Una alícuota de bacterias tratadas igualmente de cada lote se sometió a electroporación con 1 l de Tris-EDTA (TE) tampón pero sin ADN (transformación simulacro), diluido en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos para estimar el número de células perdidas por la entrega de la pulso eléctrico. Por último, una variación adicional para el experimento se llevó a cabo para determinar si los 30 min incubaciones a 37 ° C en 1 ml de LB después de la electroporación, pero antes de placas en LB-agar afectarían a la recuperación de las células transformadas. unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeraron al día siguiente. Para este experimento se emplearon pUC18, un plásmido de laboratorio común, y lotes de bacterias competentes que consiste de unproximadamente 10 8 UFC de células preparan utilizando el método tradicional y 10 7 UFC de células preparadas utilizando el protocolo rápido. La electroporación solo (sin ADN) redujo las UFC viables por 10-100 veces independientemente del método utilizado para preparar las células electrocompetentes. Como se muestra en la Tabla 1, el rendimiento transformante era dentro de la 10 6 -10 7 UFC / g de gama ADN en tres experimentos duplicados (desviaciones estándar entre paréntesis) para E. coli (DH5a) y V. cholerae (O395), respectivamente, utilizando el método tradicional, más largo para la preparación de células electrocompetentes. Rendimiento transformante apareció disminuido 10 veces a 10 5 -10 6 UFC / g de ADN en tres experimentos duplicados (desviación estándar entre paréntesis) para E. coli y V. cholerae, respectivamente, utilizando el método rápido. Por esta razón se determinó el porcentaje de bacterias transformadas dividiendo UFC transformadaspor el número de CFUs se recuperó de "transformaciones simulacros" (sin plásmido) de lotes de otro modo idénticas de células competentes. El porcentaje de bacterias transformadas se encontraba dentro de un registro (02.05 a 09.04%), independientemente del método de preparación y las especies transformadas (Tabla 1 Los números entre corchetes). Estos resultados sugieren que la eficacia del método rápido es comparable a la del procedimiento tradicional más largo de la preparación de células competentes y que las cepas representativas de Vibrio cholerae y Escherichia coli son igualmente susceptibles al procedimiento rápido. Se encontró que la eficiencia de transformación, para los plásmidos pUC18 como portadores de casetes β-lactamasa, no se ve afectado por el tiempo de recuperación de 30 minutos en caldo LB. El mismo número de transformantes fue recuperado si las células se colocaron en placas de agar LB que en presencia de ampicilina directamente, después de la electroporación, o si se les permitió un tiempo de recuperación de 30-45 minen caldo LB a 37 ° C antes de chapado. Nuestros resultados que resistencia a la ampicilina no requiere derivación en condiciones no selectivas sugiere que la expresión de β-lactamasa se ​​produce con suficiente rapidez después de la transformación. Sin embargo, cabe señalar que hemos llevado a cabo diluciones en serie de bacterias de impulsos en caldo LB, que puede haber contribuido a la recuperación de la descarga eléctrica e iniciar la expresión génica. Figura 1. Representación gráfica de la metodología para la preparación rápida de bacterias electrocompetentes. Después de 4-6 horas (dependiendo de la densidad de los inóculos) un número suficiente de bacterias se pueden recoger para llevar a cabo cinco y cincuenta y seis transformaciones de una sola placa de agar LB. Para asegurar igual número de células competentes para cada volumen final que se electroporación, las bacterias recogidas de la placa de agar LB se agruparon inicialmente juntos y se lavaron a continuación coliquoted en 40 volúmenes mu l, dependiendo del tamaño de la pastilla (gránulos más grandes se diluyeron en volúmenes más grandes divisibles por 40 l). Número de ADN transformantes / mg resistentes a la ampicilina (transformantes resistentes a la ampicilina se recuperaron [%]) Tensión Método tradicional Método rápido De E. coli (DH5a) 2.3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9.4%] 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2.5%] V. cholerae (O395) 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] 6.7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3.3%] Tabla 1. Eficacia de la transformación por microgramo de ADN (pUC18) de electrocompetentes Bacteria preparado por el método tradicional en comparación con el método rápido. Todas las transformaciones se llevaron a cabo con 500 ng de DNA de pUC18 (~ ADN superenrollado 80% como se visualiza por electroforesis en gel de 1% de agarosa) y las células sometidas a electroporación se diluyeron en serie de 10 veces en caldo LB antes de chapado de UFC en LB-agar con antibióticos. Controles de bacterias no electroporación y de bacterias por electroporación sin plásmido, se diluyeron en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos se llevaron a cabo para cada conjunto de transformaciones para determinar el número total de bacterias viables antes y después del pulso. Los controles electroporadas representadas la línea de base para el porcentaje de bacterias viables transformados con éxito.