Быстрое Протокол по подготовке Электрокомпетентные<em> Кишечная палочка</em> И<em> Холерный вибрион</em

Мы провели ряд преобразований с Е. палочка и В. вибрион сравнить эффективность трансформации нашего быстрого методологии с адаптации метода (традиционной), впервые описанного Dower др.. 2 для подготовки электрокомпетентных бактерий. Для проведения традиционной подготовки компетентных клеток 500 мл LB в 2 л колбу Эрленмейера-инокулировали 500 мкл ночной культуры E. палочка DH5α или В. вибрион O395, инкубировали в орбитальном шейкере (215 оборотов в минуту при 37 ° С) и собирают при OD 600 в интервале 0,5-1,0. Колбу охлаждают на льду и культуры центрифугируют в предварительно охлажденной ротора при 4000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Клеточные осадки тщательно ресуспендируют в 500 мл охлажденного льдом 2 мМ CaCl 2 на V. вибрион и DDH 2 O для Е. палочка, и снова центрифугировали при тех же условиях. Последующие раунды ресуспендирующего апд центрифугирование проводили в уменьшении объемов 200 и 100 мл объемы убедившись, что культура оставалась охлажденной при 4 ° С. Наконец, ресуспендирования и центрифугирования в объеме 10 мл проводили с 10% глицерина. Конечный осадок ресуспендировали в 2 мл 10% глицерина и 40 мкл аликвоты были заморожены при -80 ° С и хранили не дольше, чем за одну неделю до электропорации. Условия электропорации в том числе импульсных установок и размер кюветы были идентичны для обоих видов бактерий во всех electroporations независимо от способа получения компетентных клеток. Разница была лишь в том, что мы выполняли моет в холодной DDH 2 O для Е. палочка и холодной 2 мМ CaCl 2 для V. вибрион. Таблица 1 показывает результаты бактерии, трансформированные путем электропорации одинаково, но оказанные компетентным либо с быстрым протоколом или с традиционным методом. Мы использовали штамм O395 и DH5α так часто,лы, используемые, представительства штаммы V. вибрион и Е. палочка соответственно; аналогичные результаты могут быть получены с другими штаммами тех же видов (хотя и не каждый штамм был протестирован) и, вероятно, адаптированы к другим грамотрицательных бактерий и, возможно, за ее пределами. Чтобы гарантировать, что равное количество клеток присутствовали в каждой партии импульсного, Электрокомпетентные бактерии, полученные используя быстрый метод, объединяли после погашения, смешанные, продолжал равномерно приостановлено, и аликвоты в 40 мкл объемы незадолго до электропорации. Электрокомпетентные бактерии, созданные использующие традиционный метод, обрабатывали аналогичным перед замораживанием в 40 мкл аликвоты. После родов импульса, каждая партия 40 мкл электропорированные бактерий было приостановлено в 400 мкл LB и серийно разводили 1:10. Сто мкл каждого разведения высевали на LB-агаре в присутствии 100 мкг / мл ампициллина и распространение с использованием стерильной стекло клеток распределительи инкубировали при 37 ° С в течение ночи. Для количественной оценки общего количества бактерий, используемых в каждой трансформации, 40 мкл объемы электрокомпетентных бактерий каждого подготовленной порции серийно разводили и высевали на LB-агар без антибиотиков одинаково параллельно. Один Аликвота одинаково обработанных бактерий из каждой партии электропорировали с 1 мкл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфер, но без ДНК (макет преобразование), серийно разведенной и высевали на LB агар без антибиотиков для оценки количества клеток, потерянных на поставку электрический импульс. И, наконец, еще один вариант для эксперимента проводили для определения того, 30 мин инкубации при 37 ° С в 1 мл LB после электропорации но до посева на LB-агар повлияет на восстановление трансформированных клеток. колониеобразующих единиц (КОЕ) были перечислены на следующий день. Для этого эксперимента мы использовали pUC18, общий лабораторный плазмиды, и партии компетентных бактерий, состоящий изpproximately 10 8 КОЕ для клеток получают, используя традиционный метод и 10 7 КОЕ для клеток, полученных с использованием быстрого протокол. Одна Электропорацию (без ДНК) уменьшается жизнеспособных КОЕ на 10-100 раз независимо от метода, используемого для получения Электрокомпетентные клетки. Как показано в таблице 1, трансформант выход был в пределах 10 6 -10 7 КОЕ / мкг ДНК в диапазоне трех повторных экспериментов (стандартные отклонения в скобках) для Е. палочка (DH5α) и В. вибрион (O395) соответственно с использованием традиционного, более длительная метод электрокомпетентные клеточного препарата. Трансформант выход появился уменьшенный в 10 раз до 10 5 -10 6 КОЕ / мкг ДНК в трех повторных экспериментов (стандартное отклонение в скобках) для Е. палочка и В. вибрион соответственно с помощью экспресс-методу. По этой причине мы определили процент трансформированных бактерий путем деления трансформированных КОЕна число КОЕ извлекают из "ложный преобразований" (без плазмиды) от других идентичных партий компетентных клеток. Процент трансформированных бактерий было в течение одного журнала (2.5-9.4%), независимо от способа приготовления и видов трансформированных (Таблица 1 номера в скобках). Эти результаты показывают, что эффективность метода быстрого сравнима с традиционной более длительного порядке подготовки компетентных клеток и что представитель штаммы холерных и кишечной палочки в равной степени поддаются быстрой процедуры. Мы обнаружили, что эффективность трансформации, для плазмид, как pUC18 укрывательство β-лактамаз кассеты, не влияет на 30 мин времени восстановления в LB бульоне. Такое же количество трансформантов выдел ли, были ли клетки высевали на LB-агаре в присутствии ампициллина непосредственно после электропорации или им было позволено ли на 30-45 минут время восстановленияв LB бульоне при 37 ° С до обшивки. Наши выводы, что устойчивости к ампициллину не требует вырост под неселективных условиях предполагает, что выражение β-лактамазы происходит достаточно быстро при трансформации. Тем не менее, следует отметить, что мы провели серийных разведений импульсных бактерий в LB бульоне, который может способствовать восстановлению от поражения электрическим током и инициировать экспрессию генов. Рисунок 1. Графическое изображение методологии быстрого приготовления электрокомпетентных бактерий. После 4-6 ч (в зависимости от плотности инокулята) достаточное количество бактерий может быть собрана для выполнения 5:56 преобразования из одного LB агаром. Для обеспечения равного количества компетентных клеток для каждого конечного объема быть электропорации, бактерии, собранные из чашки с агаром LB, были первоначально объединены вместе и промывают затем др.iquoted в 40 мкл объемы в зависимости от размера гранул (более крупные гранулы разводили в больших объемах, кратных 40 мкл). Количество Устойчивые к ампициллину трансформанты / мкг ДНК (Устойчивые к ампициллину трансформанты восстановлены [%]) Штамм Традиционный метод Скоростной метод Кишечная палочка (DH5α) 2,3 х 10 6 (± 7,3 × 10 5) [9.4%] 3 × 10 6 (± 7,1 × 10 5) [2,5%] В. вибрион (O395) 4 х 10 7 (± 1,7 х 10 7) [5%] 6,7 х 10 5 (± 2,1 × 10 5) [3.3%] Таблица 1. Эффективность трансформации на микрограмм ДНК (pUC18) из электрокомпетентные бacteria получают путем традиционного метода по сравнению с быстрым методом. Все преобразования проводились с 500 нг ДНК pUC18 (~ 80% суперспиральной ДНК, визуализировали путем электрофореза в 1% агарозном геле) и электропорации клетки серийно разводили в 10 раз в LB бульоне до покрытие для КОЕ на LB-агаре с антибиотиками. Управление не-электропорации бактерий и бактерий электропорации без плазмиды, серийно разводили и высевали на LB-агар без антибиотиков проводили для каждого набора преобразований, чтобы определить общее количество жизнеспособных бактерий до и после пульсирует. Электропорированные управления представлены базовую линию для процента жизнеспособных бактерий успешно трансформированных.