Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em> 대장균</em>와<em> 콜레라 균</em

우리는 E.로 변환 세트를 실시 대장균 및 V. 콜레라는 원래 electrocompetent 박테리아의 준비를 위해 결혼 지참금 등. 2에 의해 기술 (전통적인) 방법의 적응과 우리의 빠른 방법의 변환 효율을 비교합니다. 적격 세포의 전통적인 제조를 수행하기 위해, 2-L 삼각 플라스크에 500 ㎖의 LB는 E. 500 μL 하룻밤 배양 접종했다 대장균 DH5α 또는 V. 진탕 기 (37 ° C에서 215 RPM)에서 배양하고 0.5 ~ 1.0 사이의 OD 600에서 수확의 cholerae O395. 플라스크를 얼음 냉각시키고, 문화를 4 ℃에서 10 분 동안 4,000 XG에서 미리 냉장 회에서 원심 분리 세포 펠렛을 철저히 V. 500 ML 얼음처럼 차가운 2 ㎜ 염화칼슘에 재현 탁 E. 용 콜레라와 DDH 2 O 콜라이, 다시 원심 분리하여 동일 조건 하에서. 재 부유의 후속 라운드D 원심 분리는 반드시 문화가 4 ℃에서 냉장 유지하고 200의 볼륨과 100 ㎖의 볼륨을 감소 실시 하였다 마지막으로, 10 ml의 부피에서 재 부유하고 원심 분리를 10 % 글리세롤로 행했다. 최종 펠렛은 2 ㎖의 10 % 글리세롤에 재현 탁하고, 40 ㎕의 분취 액은 -80 ° C에서 냉동하지 전에 일렉트로 1 주일보다 더 이상 저장되었습니다. 펄스 설정과 베트의 크기를 포함 일렉트로 조건에 관계없이 유능한 세포의 준비 방법의 모든 electroporations 두 종의 박테리아에 대한 동일했다. 유일한 차이는 우리가 감기 DDH에서 E. 2 O를 세척을 실시이었다 대장균 및 V. 감기 2 ㎜ 염화칼슘 콜레라. 표 1과 동일하지만, 빠른 프로토콜을 사용하거나 전통적인 방법 중 하나를 관할 렌더링 일렉트로에 의해 변형 박테리아의 결과. 우리는 일반적으로 변형 O395과 DH5α를 사용V.의 LY 사용, 대표 변종 콜레라와 E. 각각 대장균, 유사한 결과 (매일 변형이 테스트되었습니다되지이기는하지만) 같은 종의 다른 변종을 얻을 가능성이 아마 넘어 다른 그람 음성 세균에 적용 할 수 있습니다. 동일한 세포 수는 펄스 각각의 배치에 존재 것을 확실히하기 위해, 빠른 방법을 이용하여 생성 electrocompetent 박테리아, 수집에 풀링 혼합, 균일하게 정지 보관하고, 곧 이전의 일렉트로 40 μL 볼륨에 분주했다. 전통적인 방법을 이용하여 생성 Electrocompetent 박테리아는 유사 이전의 40 μL 씩 분주 동결로 처리 하였다. 펄스가 송달 된 후, 40 ㎕의 electroporation하여 박테리아의 각 배치는 400 ㎕의 LB에 중단 및 직렬 1시 10분 희석시켰다. 각 희석 백 마이크로 리터는 100 ㎍ / ㎖의 암피실린의 존재에 LB 한천에 도금 및 멸균 유리 셀 스프레더를 사용하여 확산되었다밤새 37 ° C에서 배양 하였다. 각각의 형질 전환에 사용 박테리아의 총 수를 정량화하기 위해, 각각 준비 배치 electrocompetent 박테리아의 40 μL 볼륨은 순차적 희석하고, 동일하게 평행 항생제없이 LB 한천 배지에 플레이 팅 하였다. 각 배치에서 동등하게 취급 박테리아 중 하나 분취 DNA가없는 1 ㎕의 트리스-EDTA (TE) 버퍼 만 (모의 변환), 직렬로의 배송을 잃은 세포의 수를 추정하기 위해 항생제없이 희석 LB 한천에 도금 일렉트로했다 전기 펄스. 마지막으로, 실험에 하나의 추가 변화는 일렉트로하지만 LB 한천에 도금하기 전에이 형질 전환 된 세포의 회복에 영향을 미칠 후 1 ㎖의 LB에 37 ° C에서 30 분 배양 여부를 결정하기 위해 실시 하였다. 콜로니 형성 단위 (CFUs)는 다음 날에 열거 하였다. 이 실험을 위해 우리는 한 pUC18, 일반적인 실험실 플라스미드를 고용하고 유능한 박테리아의 일괄 처리로 구성된pproximately 세포에 대한 10 8 CFUs는 기존의 방법과 빠른 프로토콜을 이용하여 제조 된 세포에 대한 10 7 CFUs을 이용하여 제조. (DNA)없이 단독으로 일렉트로 무관 electrocompetent 세포를 제조하는데 사용되는 방법의 접어 10-100에 의해 실행 가능한 CFUs을 감소시켰다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 형질 전환 수율은 E. 세 복제 실험 (괄호 안은 표준 편차)의 DNA 범위의 10 6 -10 7 CFUs / μg 이내였다 대장균 (DH5α) 및 V. 콜레라 (O395)는 각각 electrocompetent 전지 제조를위한 전통, 더 긴 방법을 사용하여. 형질 전환 수율은 E. 세 복제 실험 (괄호 안은 표준 편차)에있는 DNA의 10 5 -10 6 CFUs / μg 감소 10 배 등장 대장균 및 V. 신속한 방법을 이용하여 각각의 cholerae. 따라서 우리는 변형 CFUs 나누어 변형 박테리아의 비율을 결정CFUs의 수는 유능한 세포의, 그렇지 않으면 동일한 일괄 처리에서 (플라스미드없이) "모의 변환"에서 회복하여. 형질 전환 된 박테리아의 비율에 관계없이 준비하고 (표 1 괄호 숫자) 변환 종의 방법의 하나의 로그 (2.5-9.4 %) 이내였다. 이러한 결과는 빠른 방법의 효율성 유능한 세포를 준비하고 콜레라 균과 대장균의 대표 균주가 빠른 절차에 동등하게 의무가 있는지의 전통적인 더 긴 절차의 비교입니다 것이 좋습니다. 우리는 β-락타 마제 카세트를 숨겨을 pUC18 같은 플라스미드를 들어, LB의 국물에 30 분 복구 시간에 영향을받지 않습니다, 그 변환 효율을 발견했다. 형질 전환 체의 동일 개수가 직접, 전기 천공 후에, 또는 그들이 30-45 분 복구 시간을 허용되었는지 세포 앰피 실린의 존재하에 LB 한천 배지에 도말 여부를 회수했다이전 도금 37 ° C에서 LB의 국물에. 암피실린 저항은 비 선택적 조건 하에서 부산물을 필요로하지 않는다는 것을 우리의 연구 결과는 β-락타 마제 발현이 변형에 충분히 빠르게 발생하는 것을 제안합니다. 그러나, 우리는 감전으로부터 회복에 기여하고 유전자 발현을 시작할 수도 LB 액체 배지에서 펄스 ​​박테리아의 희석으로 이루어진 것을 주목해야한다. 그림 1. electrocompetent 균의 신속한 제조를위한 방법론의 그래픽 묘사. 4-6 시간 후 (접종원의 밀도에 따라) 박테리아의 충분한 숫자는 단일 LB 한천 플레이트에서 4-6 변환을 수행하기 위해 수집 될 수있다. 일렉트로 될 각 최종 부피에 대한 적격 세포의 동일한 수를 확보하기 위해, LB 아가 플레이트로부터 수집 된 박테리아는 초기 앨라배마 후에 함께 모으고 세정펠렛의 크기에 따라 40 μL 볼륨에 iquoted (큰 펠릿은 40 μL로 나누어 큰 볼륨에 희석). 암피실린 내성 형질 전환 / μg의 DNA 수 (암피실린 내성 형질 전환 회복 [%]) 변형 전통적인 방법 빠른 방법 대장균 (DH5α) 2.3 × 10 6 (5 10 × 7.3 ±) [9.4 %] 3 × 10 6 (5 10 × 7.1 ±) [2.5 %] V. cholerae의 (O395) 4 × 10 7 (7 ~ 10 X 1.7 ±) 5 %] 6.7 × 10 5 (5 10 × 2.1 ±) [3.3 %] 표 1. electrocompetent B의 DNA (을 pUC18)의 마이크로 그램 당 변환 효율acteria 신속한 방법에 비해 전통적인 방법으로 제조. 모든 변형은 (1 % 아가로 오스 겔 전기 영동으로 가시화로 ~ 80 % 수퍼 코일 DNA) 500 ng를 한 pUC18 DNA로 수행하고, 일렉트로 셀 직렬 항생제 LB 한천에 CFU를 위해 도금 이전에 LB 액체 배지에서 10 배 희석 하였다. 비 일렉트로 박테리아 플라스미드없이 electroporation하여 박테리아의 컨트롤이 직렬 항생제없이 희석하고, LB 한천에 도금 전에 깜박임 후의 생균의 총 수를 결정하기 위해 변환의 각 세트에 대해 수행 하였다. 일렉트로 컨트롤 성공적 형질 생균의 퍼센트에 대한 기준선을 나타낸다.