エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em>エシェリヒア·コリ</em>と<em>コレラ菌</em

我々はEで変換のセットを行った大腸菌およびVもともとダワーらによって記載され（従来）方式の適応と私たちの迅速な方法論の形質転換効率を比較するためのコレラ菌。エレクトロ菌の調製のための2。テントセルの伝統的な準備を行うために、2 L-三角フラスコに500ミリリットルのLBを大腸菌 500μlの一晩培養物を接種した大腸菌 DH5αまたはVコレラ菌 O395、オービタルシェーカー（37℃、215回転）中でインキュベートし、0.5〜1.0の間のOD 600で収穫。フラスコを氷で冷却し、培養物を4℃で10分間、4,000×gで予め冷却ローター中で遠心分離細胞ペレットを完全にV. 500 mlの氷冷2のCaCl 2に再懸濁したコレラ菌および大腸菌のためのddH 2 O 大腸菌 、同じ条件下で再度遠心分離した。再懸濁ANのその後のラウンドd個の遠心分離を確認し、培養を4℃で冷却したままで作り200と100mlの体積の体積を減少させることで行った最後に10mlの体積の再懸濁および遠心分離を10％グリセロールを用いて行った。最終ペレットを2mlの10％グリセロールに再懸濁し、40μlのアリコートを-80℃で凍結せず、エレクトロポレーションの前に一週間よりも、もはや保存した。 パルス設定とキュベットサイズを含むエレクトロポレーション条件に関係なく、有能な細胞の調製方法の全てのエレクトロポレーションの両方の細菌種のために同一であった。唯一の違いは、我々は、E.のために寒さをddH 2 Oに回の洗浄を行ったということでした大腸菌およびV冷2のCaCl 2細菌の菌 。結果を表1に示すが、同一エレクトロポレーションにより形質転換されたが、迅速なプロトコルで、または従来の方法のいずれかでコンピテント。我々は共通のようにひずみO395やDH5αを採用VのLY使用、代表株コレラ菌および大腸菌大腸菌それぞれ、同様の結果が、同じ種の他の株を用いて得られた（すべての単一の株が試験されているいないが）、おそらく他のグラム陰性細菌に、おそらく越えて適合させることができる。 等しい細胞数がパルス各バッチ中に存在したことを保証するため、迅速な方法を利用して生成されたエレクトロ細菌は、回収時にプールし混合し、均一に懸濁したまま、及びダウンロードがエレクトロポレーションの前に40μlの容量ずつに分取した。伝統的な方法を利用して生成されたエレクトロ細菌は前40μlのアリコートで凍結と同様に処理した。パルスの供給に続いて、細菌エレクトロポレーション40μLの各バッチは、400μLのLBに懸濁し、連続的に1:10に希釈した。各希釈液100マイクロリットルを、100μg/ mlのアンピシリンの存在下でLB寒天上にプレーティングし、無菌のガラスセルスプレッダーを用いて広げたそして37℃で一晩インキュベートした。それぞれの形質転換に用いた細菌の総数を定量するために、それぞれの調製されたバッチのエレクトロ細菌の40μlの体積を連続希釈し、並列で同じ抗生物質を含まないLB寒天上にプレーティングした。各バッチから平等に扱わ細菌の1つのアリコートをシリアルの配信によって失われた細胞の数を推定するために抗生物質を含まないLB寒天上に希釈し、プレートし、1μlのトリス-EDTA（TE）緩衝液が、DNAなし（モックトランスフォーメーション）をエレクトロポレーションした電気パルス。最後に、実験1つの付加的な変化は、エレクトロポレーション後のが、先行LB-寒天上にプレーティング、1 mlのLB中、37℃で30分間のインキュベーションは、形質転換細胞の回復に影響を与えるかどうかを決定するために行った。コロニー形成単位（CFU）は、次の日に計数した。 この実験のために我々をpUC18、一般的な実験用プラスミドを採用し、テント細菌のバッチは、以下のものからなるpproximately細胞について10 8 CFUを、伝統的な方法を利用して調製し、細胞について10 7 CFUを、迅速なプロトコルを利用して作成した。 （DNAなしで）単独でエレクトロポレーションにかかわらず、エレクトロコンピテント細胞を調製するために使用される方法の10〜100倍にすることによって、生存CFUを減少させた。 表1に示すように、形質転換体の収量は、E.のための3回の反復実験（カッコ内の標準偏差）でのDNAの範囲の10 6 -10 7 CFUを/μgの範囲内であった大腸菌 （DH5α）およびVコレラ菌 （O395）にそれぞれエレクトロ細胞調製のための伝統的な、より長いメソッドを使って。形質転換体の収率は10 5〜10 6 CFUの/ Eの3つの繰り返し実験（カッコ内標準偏差）でのDNAμgのに減少し10倍に登場大腸菌およびV迅速な方法を用いて、それぞれコレラ菌 。この理由のため、我々は、形質転換のCFUを分割することにより形質転換された細菌の割合を決定CFUの数によってテントセルの他の点では同一バッチから（プラスミドなし） "モック変換」から回収。形質転換された細菌の割合にかかわらず（ 表1の括弧内の数字）の調製及び形質転換種の方法の一つのログ（2.5から9.4パーセント）以内であった。これらの結果は、迅速な方法の効率はコンピテントセルを調製し、 コレラ菌、大腸菌の代表的な株は迅速な手順にも等しく適していること、従来のより長い手順と同等であることを示唆している。 我々は、β-ラクタマーゼカセットを保有するプラスミドをpUC18等のために、LBブロス中で30分間の回復時間に影響されない、その形質転換効率を発見した。形質転換体の同じ数を直接、エレクトロポレーション後、またはそれらは30〜45分間の回復時間を許されたかどうかの細胞を、アンピシリンの存在下でLB寒天培地にプレーティングしたか否かを回収した37℃でLBブロス中でプレーする前に。アンピシリン耐性の非選択的な条件の下で成長を必要としないことを我々の調査結果は、β-ラクタマーゼの発現は形質転換の際に十分に高速で起こることを示唆している。しかしながら、電気ショックからの回復に寄与し、遺伝子発現を開始している可能性が、我々はLBブロス中でパルス化細菌の希釈を行うことに留意すべきである。 図1。エレクトロ細菌の迅速な調製のための方法論を示すグラフ。4-6時間後（接種物の濃度に依存する）細菌の十分な数は、単一のLB寒天プレートから五時五十六の変換を実行するために収集することができる。エレクトロポレートされるそれぞれの最終容量コンピテント細胞の等しい数を保証するために、LB寒天プレートから採取した細菌は、最初にプールし、次いでら一緒に洗浄したペレットの大きさに応じて40μlの容量でiquoted（より大きなペレットは40μLで割り切れるより大容量で希釈した）。 アンピシリン耐性形質転換体/μgのDNAの数（アンピシリン耐性形質転換が回復[％]） 歪み 伝統的方法 迅速な方法 大腸菌の （DH5α） 2.3×10 6（5 10×7.3±）[9.4％] 3×10 6（5 10×7.1±）[2.5％] コレラ菌 （O395） 4×10 7（7 10×1.7±）[5％] 6.7×10 5（5 10×2.1±）[3.3％] 表1。エレクトロBのDNAのマイクログラムあたりの形質転換効率（pUC18中）迅速な方法に比べて、従来の方法で調製acteria。 すべての変換は、（1％アガロースゲル電気泳動によって可視化されるように〜80％のスーパーコイルDNA）500 ngのpUC18のDNAを用いて実施し、そしてエレクトロポレーションした細胞を直列に抗生物質をLB-寒天上CFUのためにプレーティングする前にLBブロス中で10倍に希釈した。非細菌およびプラスミドをエレクトロポレーションすることなく、細菌のエレクトロポのコントロールは、直列に抗生物質を含まない希釈し、LB寒天上にプレーティングの前及びアフターパルス生菌数の合計を決定するために、変換の各セットに対して実施した。エレクトロポレーションコントロールは、形質転換が成功生存細菌のパーセントのためのベースラインを表した。