JoVE Journal > Biology
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biyoloji

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em> חיידקי Escherichia</em> ו<em> Vibrio cholerae</em

Published: October 08, 2013
doi:
10.3791/50684
, , ,
1Department of Biological Sciences,University of Texas Brownsville, 2Department of Medical Microbiology and Immunology,Alberta Üniversitesi, 3Biyomedikal Bilimler bölümü,University of Texas Brownsville

Özet

Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות.

Abstract

Electroporation הפך שיטה בשימוש נרחבת עבור מהירות וביעילות החדרת דנ"א זר לתוך מגוון רחב של תאים. Electrotransformation הפך את שיטת הבחירה להחדרת DNA לפרוקריוטים שאינם באופן טבעי מוכשרים. Electroporation הוא שיטת שינוי מהירה, יעילה, ויעיל שבנוסף ל-DNA מטוהר וחיידקים המוסמכים, דורשת בקר זמין מסחרי גן הדופק וcuvettes. בניגוד לשלב הפועם, הכנת תאי electrocompetent היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית כרוכים בסבבים חוזרים ונשנים של צנטריפוגה ושוטף בהפחתת כמויות של מים סטריליים, קרים, או מאגרים לא יוניים של כמויות גדולות של תרבויות גדלו שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. זמן ומאמץ ניתן לשמור על ידי רכישת תאי electrocompetent ממקורות מסחריים, אבל את הבחירה מוגבלת למועסקים בדרך כלל E. זני מעבדה coli. אנחנו הפצה מהירה בזאת ושיטה יעילה להכנת ה electrocompetent coli, אשר כבר בשימוש על ידי מעבדות בקטריולוגיה במשך זמן מה, יכול להיות מותאם לV. cholerae ופרוקריוטים אחרים. למרות שאנו לא יכולים לקבוע למי קרדיט על פיתוח הטכניקה המקורית, אנחנו עושים את זה לרשות הקהילה המדעית בזאת.

Introduction

מאז הקמתה "בתחילת 1980s 1, electroporation הפך טכניקת ביולוגיה מולקולרית נפרד, סביר להניח שהשיטה הנפוצה ביותר המועסק כדי להפוך / תאי חי transfect עם חומצות גרעין עגולות או ליניארית. פותח במקור עבור transfection של תאי אוקריוטים 1, electroporation הותאם לאחר מכן להפיכתה של א ' coli 2, 3. בבקטריולוגיה, electroporation הפך לסטנדרט במעבדה ושונתה כדי להפוך מגוון רחב של חיידקים, כולל 4 Pseudomonas גראם השלילי, Salmonellae 5, Vibrios 6, Serratiae, ו7 Shigellae; Clostridia גראם החיובי 8, 9 חיידקים, לקטובצילוס 10 ו11 Enterococci. אפילו כמה Archaebacteria הוכיחו ניתן לשינוי על ידי electroporation, כולל Methanococci </em> 12 וSulfolobus מינים 13. לסקירה מקיפה עיין און ו14 Aachmann. יעילות של שינוי על ידי electroporation היא מדווח 10-20 גבוהה פי יותר מיכולות כימיות או חום הלם 2. עם זאת, בדומה להכנת חיידקים ליכולת כימית כמותאמים על ידי דאגלס Hanahan ב1980s 15, תאים חייבים גם להיות מוכנים להיות electrocompetent.

Electroporation הוא אמצעי מהיר ויעיל של שינוי בקטריאלי, הדורש חיידקי electrocompetent, ה-DNA מטוהר, מודול בקרת דופק, המספק את הדחף החשמלי, וחדר שיכול להכיל cuvettes חד פעמי הקטן המתפקדים כהאלקטרודה. בקצרה, חיידקים קרים, מוכשרים מעורבבים עם פלסמיד דנ"א, נתון לדופק מתח גבוה בקובט, resuspended בתקשורת צמיחה, טופח על C ° 30-37 ל30-45 דקות, ולאחר מכן מצופה במדיום מוצק למחצה (אגר מזין צלחות) עם appropriate אנטיביוטיקה סלקטיבית.

בניגוד לשלב הפועם, הכנת א electrocompetent coli נותר הליך מרובה המתבצע באופן מסורתי בכמויות גדולות. בקצרה, תרבות לילה של חיידקים היא מחוסנת לתוך בקבוק Erlenmeyer עם עד 1 ליטר מרק לוריא (LB) 100 מיליליטר, גדל שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה (OD של 600 <1.0), והוא נתון לשטיפות סדרו עם שאינו סטריליים יוני חיץ או מים מזוקקי פעמיים (DDH 2 O) בהפחתת כרכים ב 4 ° C. יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשמור על התאים קרים לאורך ההליך כולו ולמנוע זיהום. זה דורש שימוש בדליי autoclaved צנטריפוגה ומאגרים לא יוניים או 2 DDH O, חממה ייקר מסלולית, צנטריפוגה במהירות גבוהה נפח גדול בקירור ומערכת של הרוטורים. חיידקי סופו של דבר הם resuspended בנפח קטן של חיץ בתוספת גליצרול 10% וaliquoted לתוך ~ כרכי μl 40, WHich מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אחסון בטמפרטורה נמוכה לעתים קרובות תוצאות ביעילות טרנספורמציה ירד בשל אובדן יכולת הקיום לאורך זמן.

תאי חיידקיים Electrocompetent גם זמינים ממגוון רחב של מקורות מסחריים אבל רק למספר מוגבל של (לעתים קרובות רקומבינציה הלקויה) E. זני coli מועסקים בכינויו מארחים להפיץ מגוון רחב של פלסמידים. כתוצאה מכך חוקרים להסתמך על שיטות בבית כדי להכין הזנים / מוטציות שלהם לשינוי.

חלופי פרוטוקול, מהיר ויעיל להכנת ה electrocompetent coli כבר בשימוש על ידי כמה מעבדות בקטריולוגיה מולקולריות כבר כמה זמן והורחב לחיידקים גראם שלילית נוספים, במקרה שלנו V. cholerae. היוזם של הפרוטוקול אינו יכול להיות מזוהה כפי שהוא כבר מותאם על ידי חוקרים אחרים לאורך זמן. השיטה המוצגת כאן נעשתה שימוש בLaboratories במשך כמעט שני עשורים, וזה המטרה שלנו הוא לשתף את הפרוטוקול הזה שימושי עם בני גילנו.

Protocol

1. הכנת תרבויות חיידקים, כלים, וריאגנטים (יום 1, אחה"צ) בשעתי אחר הצהריים המאוחרים, לחסן 1-5 מיליליטר מרק autoclaved LB בסטרילית (לדוגמא, 100 x 13 מ"מ) מבחנות זכוכית בורוסיליקט עם aliquot קטן של חיידקים (חיידק או V. cholerae). הגדר את המבחנות מחוסנת בתוף גלגלת שוכנו ב37 ° C טמפרטורה (חדר חם או חממה), הפעל את תוף ההרים במהירות גבוהה, ודגירת O / נ הכן את מפזר תא בצורה של "מקל הוקי" ממוט זכוכית על ידי חימום אמצע המוט בלהבה של מבער בונזן עד הזכוכית מתרככת ואז לכוון את העיקול בעדינות עם פינצטה או פלייר לזווית 135 ° . מחממים את המוט פעם נוספת בנקודת האמצע שבין תום והעיקול הראשון ולכופף אותו בזווית של ° 45 פנימה (בכיוון ההפוך של העיקול הראשון). הכן LB-אגר ללא אנטיביוטיקה ולשפוך לתוך צלחות פטרי בהכנהצלחות פרוטוקול electrocompetence, וLB-אגר המכילות האנטיביוטיקה המתאימה (לפי סמן ההתנגדות על הווקטור להיות electroporated), ולאחסן ב 4 ° C. הכן את המסנן מעוקר 2 מ"מ CaCl 2 פתרון לV. cholerae, או DDH החיטוי 2 O לE. coli, ולאחסן ב 4 ° C. 2. צמיחה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, בוקר) לספק של תרבות חיידקי O / N 100 μl על כל צלחת אגר LB, מניות גליצרול קפוא יכולות גם להיות מנוצלים ובאופן ישיר נמסרו לצלחת. טובלים את מפזר תא בצורת מקל הוקי ב100% EtOH, לנקז בקצרה ולשרוף EtOH שנותר כדי לעקר אותו לפני השימוש ולהתפשט. להפיץ את תרבות חיידקי 100 O μl / N באופן שווה עם מפזר תא זכוכית סטרילית כדי לוודא שלא לשבש את המשטח אגר (הפסקה). דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות, או עד שדשא דק של התפתחות חיידקים להיותמגיע להבחנה. תאים הם מוכשרים ביותר כאשר גדל באופן פעיל. 3. הכנת תאי Electrocompetent בקטריאלי (DAY 2, אחה"צ) לקצור את החיידקים עם לולאת inoculating סטרילי כדי לוודא שלא לנקב או לשבור את פני השטח של אגר. מסת חיידקי 2 מ"מ קוטר אחת מספיקה לשינוי אחד. בדרך כלל, זה דורש מגרד את פני השטח של הדשא הדק עם inoculating לולאת שתיים או שלוש פעמים. כמה דוגמאות (בדרך כלל בין 4-6) ניתן לגבות מאותה הצלחת. Resuspend המוני החיידקים ב1 מיליליטר קר כקרח 2 מ"מ CaCl 2 (לV. cholerae) או סטרילי DDH 2 O (לE. coli) ומערבבים היטב עד שאין גושים גלויים, לשמור על קרח. צנטריפוגה כל השעיה חיידקים במשך 5 דקות ב XG 5,000 בmicrocentrifuge קירור מוגדר 4 ° C, או בmicrocentrifuge מאוחסנים בחדר קר מוגדר 4 ° C. בטל supernatant, resuspבסופו של גלולה החיידקים באותו הנפח של קר כקרח 2 מ"מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O, וחזור על צעד צנטריפוגה כפי שנעשה לפני עוד פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. הסר supernatant, resuspend, ולאחר מכן לשחרר את הכדור בקטריאלי ביסודיות ב40 קרח קר μl 2 מ"מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O ולשמור על קרח. 4. טרנספורמציה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, אחה"צ) הוסף עד 1 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (במי μl עד 1 או חיץ טריס-EDTA) להשעית חיידקי 40 μl ולהעביר את התערובת לתוך קובט טרום צונן, סטרילית פער 0.2 סנטימטר. ריכוז המלח בדגימת DNA חייב להיות נמוך, כפי שהוא יתרום לקשתי של הדופק בשלב הבא. הכנס את קובט לתוך תא electroporation של מודול בקרת דופק, וelectroporate ב1.8 KV, 25 μF. קבוע הזמן צריך להיות ~ 5.0 אלפיות שני, ולא קשתיים צריכים להתרחש. במהירות לשחזר את ההשעיה התא על ידי resuspending לתוך 1 מיליליטר מרק LB ולהעביר לתוך מבחנת זכוכית ורוסיליקט autoclaved בעבר. אפשר התאים להתאושש על ידי דוגרים בתנאי צמיחת סודה (בתוף גלגלת) על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ללא בחירה אנטיביוטיות. פלייט החיידקים על גבי הצלחות אגר LB הכינו בעבר בנוכחות הסוכן המתאים סלקטיבית (אנטיביוטיקה), ולדגור על 37 מעלות CO / נ אם חיידקים הופכים עם ריכוז גבוה של וקטור מטוהר (0.1-1 מיקרוגרם פלסמיד supercoiled), לספק 10 μl של תרבות חיידקים על קצה הצלחת אגר LB ועם פס inoculating לולאת סטרילי למושבות מבודדות בשיטת הפס ברבע. אם תערובת קשירה הפכה, לספק של תרבות חיידקים 100 μl על כל צלחת אגר ולהתפשט באופן שווה את זה עם מפזר תא זכוכית המעוקרת. אם קבוע הזמן קצר (להיות3.5 msec נמוכים), או פועם מוביל קשתי, ואז שוב לזרז את דגימת DNA, לשטוף עם EtOH 70% פעמיים כדי להסיר מלחים לפני הייבוש וresuspending במאגר TE.

Representative Results

בצענו סדרה של תמורות עם א ' coli ו V. cholerae כדי להשוות את יעילות הפיכתה של מתודולוגיה המהירה שלנו עם עיבוד של השיטה (המסורתית) שתוארה במקור על ידי דוואר et al. 2 להכנת חיידקי electrocompetent. כדי לבצע את ההכנה המסורתית של תאים המוסמכים, 500 מיליליטר LB בבקבוק L-Erlenmeyer 2 היו מחוסן עם תרבות לילה 500 μl של E. coli DH5α או V. cholerae O395, מודגרות בייקר מסלולית (215 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס) ונקטף בOD 600 של בין 0.5-1.0. הבקבוק קורר על קרח והתרבויות centrifuged ברוטור טרום צונן ב4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C. כדורי התא היו מושעים באופן יסודי ב500 מיליליטר קר כקרח 2 מ"מ CaCl 2 לV. 2 O cholerae וDDH לE. coli, וcentrifuged שוב באותם תנאים. הסבבים הבאים של resuspensionצנטריפוגה ד בוצעה בהפחתת כרכים של 200 ו100 מיליליטר כרכים לוודא התרבות נשארה צוננת ב 4 ° C. לבסוף, resuspension וצנטריפוגה ב10 מיליליטר נפח בוצעו עם גליצרול 10%. גלולה הסופית resuspended ב 2 מיליליטר גליצרול 10% ו40 aliquots μl הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס ומאוחסנים לא יותר משבוע לפני electroporation אחד. תנאי electroporation כוללים הגדרות דופק וגודל קובט היו זהים לשני מיני החיידקים בכל electroporations ללא קשר לשיטת הכנה של תאים המוסמכים. ההבדל היחיד היה שבצענו את שטיפות ב DDH 2 O הקר לE. coli וקר 2 מ"מ CaCl 2 לV. cholerae. טבלת 1 מראה תוצאות של חיידקים הפכו על ידי electroporation זהה אך שניתנו מוסמך או עם הפרוטוקול המהיר או בשיטה המסורתית. אנחנו עובדים O395 המתח וDH5α כנפוץמשמשים ly זנים, נציג של V. cholerae וא coli בהתאמה; ניתן להשיג תוצאות דומות עם זנים אחרים מאותו המין (אם כי לא כל זן נבדק) וסביר להניח שמותאמת לחיידקים גראם שלילית אחרים וכנראה מעבר לה. כדי להבטיח שמספרים סלולריים שווים נכחו בכל אצווה פעמה, חיידקי electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המהירה היו נקווים על בסיס הגבייה, מעורב, המשיכו מושעה homogenously, וaliquoted בכרכי μl 40 זמן קצר לפני electroporation. חיידקי Electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המסורתית טופלו באופן דומה לפני ההקפאה ב40 aliquots μl. בעקבות מסירה של הדופק, כל אצווה של 40 μl חיידקי electroporated הושעה ל400 μl LB ומדולל 1:10 סדרתי. מאה מיקרוליטר של דילול כל היו מצופה על אגר LB בנוכחות 100 אמפיצילין מיקרוגרם / מיליליטר ולהפיץ באמצעות מפזר תא זכוכית סטריליתוטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לכמת את המספר הכולל של חיידקים המועסקים בכל שינוי, 40 כרכי μl של חיידקי electrocompetent של כל מנה מוכנה היו בדילול סדרתי, ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה באופן זהה במקביל. aliquot אחד מחיידקים שטופלו באופן שווה מכל אצווה היה electroporated עם 1 μl טריס-EDTA (TE) חיץ אך ללא DNA (שינוי מדומה), באופן סדרתי בדילול מלא ומצופה על אגר LB ללא אנטיביוטיקה כדי לאמוד את מספר התאים שאבדו במשלוח של דופק חשמלי. לבסוף, וריאציה נוספת אחד לניסוי בוצעה כדי לקבוע אם 30 incubations דקות על 37 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר LB לאחר electroporation אבל לפני ציפוי על LB-אגר ישפיע על ההתאוששות של תאים מותמרים. יחידות מושבה להרכיב (CFUs) נפקדו ביום הבא. לצורך ניסוי זה אנו מועסקים pUC18, פלסמיד מעבדה משותף, וקבוצות של חיידקים המוסמכים בהיקף שלpproximately 10 8 CFUs לתאים שהוכן תוך ניצול השיטה המסורתית ו10 7 CFUs לתאים שהוכנו על ניצול הפרוטוקול המהיר. Electroporation לבד (בלי ה-DNA) מופחת CFUs קיימא על ידי 10-100 לקפל ללא קשר לשיטה המשמשת להכנת תאי electrocompetent. כפי שניתן לראות בטבלה 1, תשואת transformant הייתה בתוך 10 6 -10 7 CFUs / מיקרוגרם של טווח ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיות תקן בסוגריים) לE. coli (DH5α) וV. כולרה (O395) בהתאמה תוך שימוש בשיטה המסורתית, ארוכה יותר להכנת תא electrocompetent. תשואת Transformant הופיעה ירד 10 קיפול ל10 5 -10 6 CFUs / מיקרוגרם של ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיית תקן בסוגריים) לE. coli ו V. cholerae בהתאמה תוך שימוש בשיטה המהירה. מסיבה זו אנו קובעים את אחוז החיידקים הפכו על ידי חלוקת CFUs הפךבמספר CFUs התאושש מ" תמורות מדומה "(ללא פלסמיד) מקבוצות אחרות זהות של תאים המוסמכים. אחוז של חיידקים שינו היה בתוך יומן אחד (2.5-9.4%) ללא קשר לשיטה של הכנה ומינים הפכו (טבלת 1 מספרים בסוגריים). תוצאות אלו מצביעות על כך שהיעילות של השיטה המהירה היא דומה לזו של ההליך הממושך המסורתי של הכנת תאים המוסמכים וכי זני הנציג של Vibrio cholerae וEscherichia coli הם לא פחות קביל על ההליך המהיר. מצאנו כי יעילות שינוי, לפלסמידים כמו pUC18 מחסה קלטות β-lactamase, אינו מושפע מזמן התאוששות 30 דקות במרק LB. אותו מספר transformants היה התאושש אם התאים היו מצופים לאגרו LB בנוכחות אמפיצילין ישירות, לאחר electroporation, ובין אם הם הורשו זמן התאוששות 30-45 דקותבמרק LB על 37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי. הממצאים שלנו שאמפיצילין התנגדות אינה דורשת תוצאה בתנאים לא סלקטיבי עולה כי ביטוי β-lactamase מתרחש מספיק מהר על שינוי. עם זאת, יש לציין שבצענו דילולים סדרתי של חיידקי פעם במרק LB, שאולי תרם להתאוששות מההלם החשמלי וליזום ביטוי גנים. איור 1. תיאור גרפי של המתודולוגיה להכנה המהירה של חיידקי electrocompetent. אחרי 4-6 שעות (תלוי בצפיפות של inocula) בכמות מספקת של חיידקים ניתן לאסוף לבצע 05:56 תמורות מצלחת אגר LB אחד. כדי להבטיח מספר שווה של תאים המוסמכים עבור כל נפח סופי שelectroporated, חיידקים שנאספו מהצלחת אגר LB היו בתחילה אספו ושטפו ביחד אז אלiquoted ב40 כרכי μl בהתאם לגודל של גלולה (כדורים גדולים יותר היו מדוללים בנפחים גדולים יותר מתחלק ב 40 μl). המספר של ה-DNA transformants / מיקרוגרם אמפיצילין עמיד (transformants אמפיצילין עמיד התאושש [%]) זן שיטה מסורתית שיטה מהירה החיידק (DH5α) 2.3 x 10 6 (± 7.3 x 10 5) [9.4%] 3 x 10 6 (± 7.1 x 10 5) [2.5%] V. כולרה (O395) 4 x 10 7 (± 1.7 x 10 7) [5%] 6.7 x 10 5 (± 2.1 x 10 5) [.3.3%] טבלת 1. יעילות טרנספורמציה למיקרוגרם של ה-DNA (pUC18) של electrocompetent בacteria שהוכן על ידי השיטה המסורתית לעומת השיטה המהירה. כל השינויים בוצעו ב500 pUC18 DNA ng (~ 80% DNA supercoiled כדמיינו ידי 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose) ותאי electroporated סדרתי היו מדוללים פי 10 במרק LB לפני ציפוי לCFU על LB-אגר עם אנטיביוטיקה. פקדים של חיידקים שאינם electroporated ושל חיידקי electroporated בלי פלסמיד, בדילול סדרתי ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה בוצע עבור כל קבוצה של טרנספורמציות כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקי קיימא לפני ואחרי פועמים. פקדי electroporated ייצגו את קו הבסיס לאחוזים של חיידקי קיימא הפכו בהצלחה.

Discussion

יעילות שינוי כפופה למגוון גורמים ללא קשר לשיטה המועסק על מנת להכין את התאים המוסמכים. משתנים מקבילים חל על שיטה זו; זהירות רבה יש לנקוט שברגע שהתאים נקצרים מהצלחת אגר כזה שהם נשמרים בטמפרטורה קבועה קרה (שלא יעלה על 4 מעלות צלזיוס). דשא החיידקים חייב להיות פעיל גדל בזמן האיסוף; תאים חייבים להיות בשלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. איכות של ה-DNA (כלומר זיהום של מלחים) משפיעה על יעילות שינוי. באופן ספציפי, כאשר בשיטה זו, אגר לא צריך להיות שבור שברים אגר בקובט יגרמו קשתי של הדופק.

רוב הבעיות נתקלו עם טכניקה זו קשורות עם שני נושאים; איסוף החיידקים במהלך החלון הנכון של זמן מהצלחת אגר כאשר הם גדלים באופן פעיל. לאסוף אותם מוקדם מדי יניבו מספרים סלולריים מספיקים ויעבדמגרד את הצלחת אגר LB מתסכל כי "pellicule" הם יוצרים קשה להרים את פני השטח של הצלחת. חיידקי איסוף מאוחר מדי יקטינו את היכולת שלהם באופן דרמטי. החלון של הזמן באופן טבעי משתנה בהתאם לצפיפות של הבידוד מצופה על הצלחות אגר LB. השלב הקריטי השני הוא לשמור על החיידקים קרים (4 מעלות צלזיוס) מהרגע שהם הרימו את הצלחת אגר וresuspended בCaCl 2 או DDH 2 O עד שהם מצופים על אגר LB הבא טרנספורמציה. צינורות microfuge המכילים חיידקים, cuvettes וחיץ צריכים להיות טרום צוננים ושמרו על קרח בכל העת עד לחיידקים הם מצופים. עם זאת, בעיות נוספות יכולות להתעורר כאשר סטרילי DDH 2 O או CaCl 2 יכיל משקע או מזוהם. מסיבה זו אנו ממליצים להכין טריים מגיב זה.

שינוי פתרון בעיות הוא הקל על ידי לרבות בקרות כאשר הפיכת bacteria שניתנו מוסמך בכל דרך. ביקורת שלילית בהיקף של קבוצה של חיידקים שאינם המוסמכים הפכו מצופים על צלחת אגר LB המכילה את הסמן סלקטיבית תהיה במהירות לעזור לקבוע אם האנטיביוטיקה על הצלחת היא יעילה. שינוי שליטה חיובי עם הכנת פלסמיד ידועה באיכות טובה ובכמות חסה באותו סמן סלקטיבית כמדגם הניסיוני יהיה מועיל בקביעה האם החיידקים הם מוכשרים, אלא גם אם ה-DNA ניסיוני הפכה די הייתה בכמות או באיכות.

היתרונות של שיטה זו הם מרובים; השיטה יכולה להתבצע באותו היום שבו שינוי מתוכנן. מצאנו כי מניית גליצרול חיידקים קפואה עשויה להיות מצופה ישירות על אגר LB בלי לפגוע בelectrocompetence, יש לנו עשיתי את זה במצבים "חירום" (לאחר שוכח להתחיל תרבות הלילה ביום שלפני). למרות שאנחנו לא יכולים לבדוק את הדוארמאוד מתח ידוע, כל E. coli או V. זן cholerae שניתן להפוך על ידי electroporation היה מקובל בפרוטוקול זה בידיים שלנו. הטכניקה היא מהירה, יעילה, ויעילות הפיכת תשואות דומה לאלה המתקבלים מהכנת חיידקי electrocompetent בשיטות מסורתיות. השיטה מבטלת את הדרישה לצנטריפוגה במהירות גבוהה והרוטורים קשורים, שייקר אינקובטור מסלולית ודליי סטרילי צנטריפוגות (מכולות), וכמויות גדולות של חיץ autoclaved. למרות שהטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים היא מקיפה למדי, רוב מעבדות המבצעות electroporation תהיה רוב, אם לא כולם, של חומרים אלה כבר זמינים. ואולי הכי חשוב, הטכניקה יכולה להיות מיושמת בקלות כדי ליצור זני מעבדה ספציפית electrocompetent עם רקע מוטציה במהירות. אנו מודעים לכל מגבלות של טכניקה זו כפי שהוא החליף את השיטה המסורתית של הכנת electrocompetent חיידקים במעבדות שלנו.

התוצאות של הניסויים שלנו הראו כאן בוצעו בתאי electrocompetent טריים המיוצרים בשיטה המסורתית שאוחסנה ב-80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 שבוע. עם זאת, מניות תא electrocompetent קפוא מאבדות יכולת ואו יכולת קיום לאורך תקופות ממושכות של שטח האחסון. הפרוטוקול המקוצר שלנו מאפשר ההכנה של תאי electrocompetent טריים באותו היום את השינוי מתוכנן חששות לגבי גיל של המניה אשר עלול לגרום לתשואת transformant ירדה בלי. אנחנו לא ניסינו אחסון תאי electrocompetent הופקו באמצעות השיטה המהירה לשימוש ביום אחר כמו זה לא היה נחוץ.

אמנם לא מוצג כאן, את היעילות של תאי electrocompetent הוכנה באמצעות השיטה המהירה שלנו היא מספיק לתערובות קשירה. התמורות שדווחו לאינו O1 V. cholerae במאמר שפורסם לאחרונה על ידי Unterweger et al.17 בוצעו באמצעות חיידקי electrocompetent שהוכנו על ידי השיטה המתוארת כאן (פרט לאלה שבוצעו על ידי נטיה). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להפוך את הזנים בעלי רקע מוטציה במהירות וביעילות ללא צורך להכין קבוצות גדולות של תאים. הכנה מהירה זה של שיטת חיידקי electrocompetent יכולה להיות מותאמת לפרוקריוטים אחרים שהוכחו להיות מקובל electroporation כעיקרון של הכנה והגדרות electroporation הולכים להיות זהה לאלה של פרוטוקולים מסורתיים.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לעמיתיו ואנשי צוות של מעבדות בהווה ובעבר שתמכו בפיתוח טכניקה זו שלהם. המעבדה של SP נתמך על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות ההפעלה גרנט MOP-84,473 ופתרונות אלברטה מתפתחת-בריאות (ממומנים על ידי הקרן למורשת אלברטה למחקר רפואית קרן קרן). DP של נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה MD001091-01 וGM068855-02.

Materials

Name of the Equipment Company Catalogue number
Gene Pulser Module Bio-Rad 165-2668
Gene Pulser Cuvette Chamber Bio-Rad 165-2669
Electrocuvettes (0.2 cm gap) Bio-Rad 165-2082
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes Corning 70820-13
13 mm Culture Tube Closures Cole Parmer EW-04500-00
6 x 250 mm Glass Rod Lab Source 11381D
Disposable Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12
Roller Drum Motor Assembly New Brunswick Scientific M1053-4004
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes New Brunswick Scientific M1053-0306
Calcium chloride Sigma Chemicals C5670
Ethanol, anhydrous/denatured Sigma Chemicals 227649
Inoculating Loop Decon Labs MP182-5
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R Eppendorf 22621425
Bunsen Burner Fisher Scientific 03-917Q
LB Broth MILLER EMD 1.10285.0500
Bacteriological Agar Fisher Scientific S25127

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  3. Taketo, A. DNA transfection of Escherichia coli by electroporation. Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).
  4. Fiedler, S., Wirth, R. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).
  5. O’Callaghan, D., Charbit, A. High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).
  6. Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation. Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).
  7. Grones, J., Turna, J. Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).
  8. Allen, S. P., Blaschek, H. P. Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).
  9. Belliveau, B. H., Trevors, J. T. Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).
  10. Chassy, B. M., Flickinger, J. L. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).
  11. Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).
  12. Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae. J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).
  13. Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).
  14. Aune, T. E., Aachmann, F. L. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).
  16. Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages. PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).

Etiketler

ElectroporationElectrotransformationElectrocompetentE. ColiVibrio CholeraeCompetent BacteriaGene Pulse ControllerCuvettesRapid ProtocolTransformation Method

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. (80), e50684, doi:10.3791/50684 (2013).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image