Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em> Escherichia coli</em> Et<em> Vibrio cholerae</em

Nous avons effectué une série de transformations avec E. coli et V. cholerae transformation pour comparer l'efficacité de notre méthode rapide avec une adaptation de la méthode (traditionnelle) décrit à l'origine par Dower et al. 2 pour la préparation de bactéries électro-compétentes. Pour effectuer la préparation traditionnelle de cellules compétentes, 500 ml de LB dans un flacon d'Erlenmeyer de L-2 ont été inoculées avec 500 ul de culture d'une nuit de E. coli DH5a ou V. cholerae O395, incubés dans un agitateur orbital (215 rpm à 37 ° C) et récoltées à une DO 600 de 0,5 à 1,0 entre. Le ballon a été refroidi sur de la glace et les cultures centrifugé dans un rotor pré-réfrigéré à 4000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Les culots cellulaires ont été remis en suspension soigneusement dans 500 ml refroidi à la glace de 2 mM de CaCl2 pour V. cholerae et le trou DDH 2 O pour E. coli, et on centrifuge de nouveau dans les mêmes conditions. Les rondes subséquentes de la remise en suspension uned centrifugation ont été réalisés dans la diminution des volumes de 200 ml et 100 volumes en s'assurant que la culture est restée réfrigérée à 4 ° C. Enfin, une remise en suspension et centrifugation dans un volume de 10 ml a été réalisé avec 10% de glycerol. Le culot final a été remis en suspension dans 2 ml de glycerol à 10% et 40 uL d'aliquotes ont été congelées à -80 ° C et stocké non plus d'une semaine avant l'électroporation. conditions d'électroporation incluant des paramètres d'impulsion et la taille de la cuve étaient identiques pour les deux espèces de bactéries dans tous les électroporations quelle que soit la méthode de préparation de cellules compétentes. La seule différence, c'est que nous avons effectué les lavages dans le trou DDH 2 O froid pour E. coli et froide 2 mM de CaCl 2 pour V. cholerae. Tableau 1 montre les résultats de bactéries transformées par électroporation à l'identique mais rendues compétentes, soit avec le protocole rapide ou avec la méthode traditionnelle. Nous avons utilisé la souche O395 et DH5a comme communement utilisés, des souches représentatives de V. cholerae et E. coli, respectivement, des résultats similaires peuvent être obtenus avec d'autres souches de la même espèce (mais pas tous souche unique a été testée) et probablement adaptées à d'autres bactéries à Gram négatif et probablement au-delà. Pour vous assurer que le nombre de cellules égales étaient présents dans chaque lot pulsé, bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode rapide ont été réunies lors de la collecte, mixte tenue homogène suspendus, et aliquotées en 40 volumes ul peu de temps avant l'électroporation. Bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode traditionnelle ont été traités de la même avant la congélation en 40 aliquotes. Après la livraison de l'impulsion, chaque lot de 40 ul de bactéries par électroporation a été mis en suspension dans 400 ul de LB et dilué en série 01:10. Cent microlitres de chaque dilution ont été étalées sur de la gélose LB en présence de 100 ug / ml d'ampicilline et réparties au moyen d'un épandeur de cellule en verre stérileet on incube à 37 ° C pendant une nuit. Pour quantifier le nombre total de bactéries utilisées dans chaque transformation, volumes 40 ul de bactéries électrocompétentes de chaque lot préparé ont été dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique identique en parallèle. Une aliquote de bactéries aussi traités de chaque lot a été électroporation avec 1 pi de Tris-EDTA (TE) tampon mais sans ADN (transformation maquette), dilué en série et étalées sur gélose LB sans antibiotiques pour estimer le nombre de cellules perdues par la livraison de la impulsion électrique. Enfin, une variante supplémentaire de l'expérience a été réalisée pour déterminer si les 30 min d'incubation à 37 ° C dans 1 ml de LB après l'électroporation, mais avant l'étalement sur LB-agar affecteraient la récupération des cellules transformées. unités formant colonies (UFC) ont été dénombrées sur le jour suivant. Pour cette expérience, nous avons employé pUC18, un plasmide de laboratoire commun, et les lots de bactéries compétentes consistant en unnviron 10 8 UFC de cellules préparées en utilisant la méthode traditionnelle et 10 7 UFC pour cellules préparées en utilisant le protocole rapide. L'électroporation seul (sans ADN) a réduit de 10 à 100 CFU viables par pli quelle que soit la méthode utilisée pour préparer les cellules électro-compétentes. Comme le montre le tableau 1, le rendement était transformant à l'intérieur de la 10 6 -10 7 CFU / pg de plage de l'ADN dans les trois expériences répétées (écarts-types indiqués entre parenthèses) pour E. coli (DH5a) et V. cholerae (O395) en utilisant respectivement la méthode longue traditionnelle pour la préparation de cellules électrocompétentes. Rendement transformant apparu diminué de 10 fois 10 5 -10 6 UFC / pg d'ADN dans trois expériences répétées (écart-type entre parenthèses) pour E. coli et V. cholerae respectivement selon la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant UFC transforméespar le nombre d'UFC récupéré à partir de transformations "simulées" (sans plasmide) à partir de lots identiques par ailleurs des cellules compétentes. Le pourcentage de bactéries transformées était dans un journal (2.5-9.4%) indépendamment de la méthode de préparation et les espèces transformées (Tableau 1 nombres entre parenthèses). Ces résultats suggèrent que l'efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la longue procédure traditionnelle de préparation de cellules compétentes et que les souches représentatives de Vibrio cholerae et Escherichia coli sont également ouvertes à la procédure rapide. Nous avons constaté que l'efficacité de transformation, telles que pour les plasmides pUC18 hébergeant cassettes β-lactamase, n'est pas affecté par le temps de récupération de 30 min dans du bouillon LB. Le même nombre de transformants a été récupéré si les cellules ont été étalées à la gélose LB en présence d'ampicilline directement, après l'électroporation, ou si elles ont été autorisées un temps de récupération de 30 à 45 mindans du bouillon LB à 37 ° C avant le placage. Nos résultats que résistance à l'ampicilline ne nécessite pas de prolongement dans des conditions non sélectifs suggère que l'expression β-lactamase se produit suffisamment rapide lors de la transformation. Toutefois, il convient de noter que nous avons effectué des dilutions en série de bactéries dans un bouillon LB pulsés, qui peuvent avoir contribué à la récupération à partir de la décharge électrique et de déclencher l'expression du gène. Figure 1. Représentation graphique de la méthodologie pour la préparation rapide de bactéries électrocompétentes. Après 4-6 heures (en fonction de la densité de l'inoculum) un nombre suffisant de bactéries peuvent être collectées pour effectuer quatre à six transformations à partir d'une seule plaque de gélose LB. Pour assurer un nombre égal de cellules compétentes pour chaque volume final à une électroporation, les bactéries collectées à partir de la plaque de gélose LB ont d'abord été mis en commun et ensuite lavés ensemble aliquoted dans 40 volumes de pi en fonction de la taille de la pastille (grandes pastilles ont été dilués dans des volumes plus importants divisible par 40 pi). Nombre d'ADN transformants / ug d'ampicilline-résistant (transformants résistants à l'ampicilline récupérés [%]) Strain Méthode traditionnelle Méthode rapide E. coli (DH5a) 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] V. cholerae (O395) 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] Tableau 1. L'efficacité de transformation par microgramme d'ADN (pUC18) de électrocompétent bacteria préparé par le procédé traditionnel par rapport à la méthode rapide. Toutes les transformations ont été réalisées avec 500 ng d'ADN pUC18 (~ 80% d'ADN surenroulé telle que visualisée par électrophorèse sur 1% de gel d'agarose) et les cellules électroporées ont été dilués 10 fois dans du bouillon LB avant le plaquage de CFU sur LB-agar avec des antibiotiques. Contrôles de bactéries non-électroporation et de bactéries électroporées sans plasmide, dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique ont été effectuées pour chaque série de transformations afin de déterminer le nombre total de bactéries viables avant et après la pulsation. Les contrôles électroporation représentaient la ligne de base pour le pour cent des bactéries viables transformées avec succès.