对于电感受的制备快速协议<em>大肠杆菌</em>和<em>霍乱弧菌</em

我们进行了一组与大肠杆菌变换大肠杆菌和V。霍乱弧菌对我们快速的方法转化效率比较与（传统）方法最初由Dower 等 2所描述的电感受态细菌制备的一种适应。进行了传统的制备感受态细胞，加入500ml的LB在2升的三角烧瓶中接种大肠杆菌的500微升过夜培养大肠杆菌 DH5α或V。霍乱弧菌 O395，孵育在轨道摇床（215转，在37℃）和收获在0.5-1.0之间OD 600。将烧瓶在冰上冷却，并在培养物离心，在预冷的转子以4000×g离心10分钟，在4℃下将细胞沉淀物彻底在500毫升冰冷的2毫米氯化钙2为五重悬于霍乱和双蒸2 O为E。大肠杆菌 ，并再次在相同条件下离心。随后的几轮的再悬浮的ð离心分离，进行了减少的200卷和100毫升的体积使得在4℃下确定的培养维持冷藏最后，再悬浮和离心分离在一个10毫升的量，进行与10％甘油。最终的沉淀物再悬浮于2ml的10％甘油和40微升等分试样冷冻于-80℃，并存储不长于前一周电穿孔。 电穿孔条件包括脉冲设置和试管大小都相同的两个菌种中的所有电穿孔无论准备感受态细胞的方法。唯一的区别是，我们进行了清洗冷双蒸2 O为E。大肠杆菌和冷2毫米氯化钙2 V。霍乱弧菌 。 表1显示细菌通过电相同，但呈现的主管要么与快速的协议，或与传统方法转化的结果。我们采用应变O395和DH5α共同LY使用，代表五株霍乱弧菌和大肠杆菌大肠杆菌分别;类似的结果可以与相同物种的其他菌株获得的（虽然不是每个单一菌株已经过测试）以及可能适用于其它的革兰氏阴性细菌和可能超出。 为了确保平等的细胞数目存在于每个批次脉冲，产生利用快速的方法电感受态细菌汇集在收集，混合，保持均匀悬浮，并且不久之前，电分装在40微升卷。产生利用传统的方法电感受同样的细菌之前，在40微升等分冷冻治疗。分娩后的脉冲的，每批40微升电穿孔的细菌悬浮于400微升的LB和串行1:10稀释。每个稀释的一百微升接种在LB琼脂中的100微克/毫升氨苄青霉素的存在和传播使用无菌玻璃细胞吊具并在37℃培养过夜。量化细菌在每个变换采用的总数，每个批次准备的电感受态细菌的40微升体积中连续稀释，并接种在LB琼脂不含抗生素的相同并联。从每批同等对待的细菌之一等分试样电穿孔用1微升的Tris-EDTA（TE）缓冲液，但没有DNA（模拟变换），连续稀释并涂布在LB琼脂无抗生素来估计细胞的传递损失的数量电脉冲。最后，一​​个额外的变化来进行实验，以确定是否分30保温在37℃在1ml LB后电穿孔，但镀在LB-琼脂上之前，会影响转化细胞的恢复。菌落形成单位（CFU的）进行了列举翌日。 在这个实验中，我们采用pUC18中，一个常见的​​实验室质粒，并包括一个称职的细菌批pproximately 10 8 CFU的对细胞制备采用传统的方法和10 7 CFU的为准备利用快速的协议细胞。独自电（无DNA）减少可行的CFU了10-100倍，无论用于制备电感受态细胞的方法。如表1所示，转化产率是DNA的范围在三次重复实验（括号中的标准偏差）为E.在10 6 -10 7的CFUs /微克内大肠杆菌 （DH5α）和V。霍乱弧菌 （O395）分别为使用电感受细胞制备的传统，更长的方法。产量转化为E.出现下降了10倍，DNA在三次重复实验（括号内标准差）10 5 -10 6的CFUs /微克大肠杆菌和V。使用快速的方法分别霍乱 。为此，我们通过将转化CFU的决定转化细菌的百分比通过CFU的数目由“模拟转换”（不带质粒）从回收的感受态细胞中其他相同批次。转化的细菌的百分比是一个日志（2.5-9.4％）内无论制备和转化（ 表1括号内的数字）物种的方法。这些结果表明，该快速方法的效率相媲美，制备感受态细胞和霍乱弧菌和大肠杆菌的代表菌株也同样适合于快速过程的传统的冗长程序。 我们发现，转化效率，对像的pUC18质粒携带β-内酰胺酶盒，不会受到在LB培养基中30分钟的恢复时间。转化子的数目相同，回收的细胞是否接种到LB琼脂在氨苄青霉素存在下直接电穿孔后，或者它们是否被允许一个30-45分钟的恢复时间在LB前电镀液中，在37℃。我们的研究结果，即氨苄青霉素抗性并不需要非选择性条件下生长表明，β-内酰胺酶的表达发生足够快时转换。然而，应该指出的是，我们进行了脉冲细菌的系列稀释液在LB肉汤中，这可能对恢复从电击贡献，并启动基因的表达。 图1。为电感受态细菌的快速制备方法的图形描绘。后4-6小时（取决于接种物的密度）足够数量的细菌可以被收集，进行四到六个转换从一个单一的LB琼脂平板上。以确保相等数量的感受态细胞中为每个最终体积被电穿孔，从LB琼脂平板上收集到的细菌最初被收集并洗涤，然后一起人iquoted在这取决于颗粒的大小将40μl体积（较大的颗粒稀释在更大的体积约40微升）。 的氨苄青霉素抗性转化子/μgDNA的数目（氨苄青霉素抗性的转化体中回收[％]） 应变 传统的方法 快速方法 大肠杆菌 （DH5α） 2.3×10 6（±7.3×10 5）[9.4％] 3×10 6（±7.1×10 5）[2.5％] 霍乱弧菌 （O395） 4×10 7（±1.7×10 7）[5％] 6.7×10 5（±2.1×10 5）[3.3％] 表1中。电感受的B每DNA（pUC18中）微克的转化效率acteria由较快速的方法，传统的方法制备。 所有的转换进行了与500纳克的pUC18 DNA（〜80％的超螺旋DNA作为可视化通过1％琼脂糖凝胶电泳）和电穿孔的细胞进行系列稀释在LB肉汤10倍到电镀为CFU的LB-琼脂用抗生素之前。非电穿孔的细菌和细菌电穿孔的无质粒的对照，连续稀释并涂布在LB琼脂无抗生素进行了为每个组转换，以确定前和后脉冲的存活细菌的总数。电穿孔控制为代表的活菌成功转型的百分比底线。