بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em> كولاي</em> و<em> ضمة الكوليرا</em
Özet
التثقيب الكهربائي هو طريقة تستخدم عادة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا في عملية تعرف باسم التحول. البروتوكولات التقليدية لإعداد الخلايا electrocompetent هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. توضح هذه المقالة بديلة وسريعة، وسيلة فعالة لإعداد الخلايا electrocompetent المستخدمة حاليا من قبل بعض المختبرات.
Abstract
أصبح التثقيب الكهربائي وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لبسرعة وكفاءة تقديم دنا غريب في مجموعة واسعة من الخلايا. أصبح Electrotransformation الأسلوب المفضل لإدخال الحمض النووي في بدائيات النوى التي ليست مختصة بشكل طبيعي. التثقيب الكهربائي هو أسلوب التحول السريع والكفاءة، وتبسيط ذلك، بالإضافة إلى تنقية الحمض النووي والبكتيريا المختصة، يتطلب متاحة تجاريا الجينات تحكم النبض وcuvettes. وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد الخلايا electrocompetent هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة التي تنطوي جولات متكررة من الطرد المركزي ويغسل في خفض حجم العقيمة، والماء البارد، أو مخازن غير الأيونية كميات كبيرة من الثقافات نمت لمرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. يمكن حفظ الوقت والجهد من خلال شراء خلايا electrocompetent من مصادر تجارية، ولكن اختيار يقتصر على استخداما E. سلالات مختبر القولونية. نحن هنا لنشر السريع وطريقة فعالة لإعداد electrocompetent E. كولاي، والتي تم استخدامها من قبل في مختبرات علم الجراثيم لبعض الوقت، يمكن تكييفها لV. الكوليرا وغيرها من بدائيات النوى. في حين أننا لا نستطيع التأكد من أن الفضل في تطوير تقنية الأصلي، ونحن هنا مما يجعلها متاحة للمجتمع العلمي.
Introduction
منذ ان 'تأسيسها في أوائل 1980s 1، أصبح التثقيب الكهربائي تقنية البيولوجيا الجزيئية لا يتجزأ، من المحتمل واحدة الأسلوب الأكثر شيوعا المستخدمة لتحويل / بالنقل الخلايا الحية مع الأحماض النووية دائري أو خطي. وضعت أصلا لترنسفكأيشن من الخلايا حقيقية النواة 1، تم تكييفها التثقيب الكهربائي في وقت لاحق لتحويل E. القولونية 2، 3. في علم الجراثيم، أصبحت التثقيب الكهربائي معيار المختبر، وقد تم تعديلها لتحويل مجموعة واسعة من البكتيريا سالبة الجرام بما في ذلك الزائفة 4، 5 السالمونيلا، الضمات 6، Serratiae، وشيغيلات 7؛ المطثيات إيجابية الجرام 8، 9 البكتيريا، البكتريا المكونة 10 والمكورات المعوية 11. وقد ثبت حتى بعض العتائق قابلة للتحويل عن طريق التثقيب الكهربائي، بما في ذلك Methanococci </م 12> وSulfolobus الأنواع 13. لإجراء استعراض شامل يرجى الرجوع إلى لغزة وAachmann 14. كفاءة التحول عن طريق التثقيب الكهربائي يقال 10-20 أضعاف أعلى من الكفاءة الكيميائية أو الحرارة صدمة 2. ومع ذلك، مثل الكثير من البكتيريا إعداد لاختصاص الكيميائية على النحو الأمثل من قبل دوغلاس هاناهان في 1980s 15، كما يجب أن تكون مستعدة لتكون خلايا electrocompetent.
التثقيب الكهربائي هو وسيلة سريعة وفعالة للتحول البكتيرية، والتي تتطلب البكتيريا electrocompetent، الحمض النووي النقي، وحدة تحكم نبض من شأنها أن توفر الدافع الكهربائية، وغرفة تستوعب cuvettes المتاح الصغيرة التي تعمل بمثابة القطب. لفترة وجيزة، يتم خلط الباردة، والبكتيريا المختصة مع الحمض النووي البلازميد، تعرض لنبض عالية الجهد في كوفيت، معلق في وسائط النمو، المحتضنة في 30-37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة، ثم مطلي على المتوسط نصف صلبة (المغذيات آجار لوحات) مع APPRopriate المضادات الحيوية انتقائية.
وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد electrocompetent E. يبقى القولونية إجراء متعددة الأجزاء التي تتم عادة في كميات كبيرة. لفترة وجيزة، تم تلقيح ثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا إلى دورق مخروطي مع 100 مل إلى 1 لتر مرق لوريا (LB)، ونمت إلى مرحلة منتصف لوغاريتمي النمو (OD 600 من <1.0)، وتعرض ليغسل المسلسل مع غير معقمة الأيونية عازلة أو الماء المقطر المزدوج ([ده 2 O) في خفض كميات في 4 درجات مئوية. يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الخلايا الباردة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ومنع التلوث. هذا يتطلب استخدام الدلاء الطرد المركزي تعقيمها ومخازن غير الأيونية أو [ده 2 O، حاضنة شاكر المداري، كمية كبيرة عالية السرعة المبردة الطرد المركزي ومجموعة من الدوارات. ومعلق البكتيريا أخيرا في حجم صغير من العازلة تستكمل مع 10٪ الجلسرين وaliquoted في ~ 40 مجلدات ميكرولتر، ذوي الخوذات البيضاءيتم تخزين معنوى في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين درجات الحرارة المنخفضة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحول بسبب فقدان جدوى مع مرور الوقت.
الخلايا البكتيرية Electrocompetent وتتوفر أيضا من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية ولكن فقط لعدد محدود من (غالبا ما تكون ناقصة إعادة التركيب) E. سلالات القولونية استخداما باعتبارها الدولة المضيفة لنشر مجموعة واسعة من البلازميدات. ونتيجة لذلك تعتمد على أساليب الباحثين في المنزل لإعداد هذه السلالات الخاصة / المسوخ للتحول.
بديل، بروتوكول سريعة وفعالة لإعداد electrocompetent E. وقد القولونية قيد الاستخدام من قبل عدد قليل من المختبرات الجراثيم الجزيئية لبعض الوقت الآن، ولقد تم تمديد للبكتيريا سلبية الغرام إضافية، في حالة V. لدينا الكوليرا. لا يمكن تحديد المنشئ للبروتوكول كما تم تحسين من قبل باحثين آخرين مع مرور الوقت. طريقة المقدمة هنا قد استخدمت في المختبر لديناالمنشأ منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، وذلك هو هدفنا لمشاركة هذه بروتوكول مفيدة مع أقراننا.
Protocol
Representative Results
Discussion
كفاءة التحول يخضع لمجموعة متنوعة من العوامل بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإعداد الخلايا المختصة. تطبيق متغيرات مماثلة لهذه الطريقة، ويجب توخي الحذر الشديد أنه بمجرد أن يتم حصاد الخلايا من لوحة آغار بحيث يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة الباردة (لا تزيد عن 4 درجات مئوية). العشب البكتيرية يجب بنشاط متزايد في وقت جمع؛ يجب أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. نوعية الحمض النووي (أي تلوث من الأملاح) يؤثر كفاءة التحول. على وجه التحديد، عندما تستخدم هذا الأسلوب، لا ينبغي أن كسر أجار أجار في كأجزاء كفيت سوف يسبب الانحناء للنبض.
وترتبط معظم المشاكل التي واجهتها مع هذه التقنية مع قضيتين؛ جمع البكتيريا خلال نافذة السليم لوقت من لوحة أجار عندما يتم بنشاط متزايد. سوف جمعها في وقت قريب جدا تسفر عن أعداد الخلايا غير كافية وسوف تجعلكشط قبالة لوحة LB أجار محبطة لأن "pellicule" أنها تشكل من الصعب أن يقلع سطح اللوحة. البكتيريا جمع فوات الأوان ستنخفض بشكل كبير اختصاصها. سوف نافذة الوقت تختلف بطبيعة الحال اعتمادا على كثافة اللقاح مطلية على لوحات أجار LB. الخطوة الحاسمة الثانية هي للحفاظ على البكتيريا الباردة (4 ° C) من لحظة يتم رفعها من لوحة آغار ومعلق في 2 و CaCl أو [ده 2 O حتى ومطلي انهم على أجار LB التالية التحول. ينبغي للأنابيب microfuge التي تحتوي على البكتيريا، وcuvettes عازلة تكون قبل المبردة وأبقى على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم مطلي البكتيريا. ومع ذلك، يمكن أن تنشأ مشاكل إضافية عندما ده العقيمة 2 O 2 و CaCl أو تحتوي على راسب أو ملوثة. لهذا السبب نحن نوصي لإعداد هذا كاشف الطازجة.
ومما يسهل استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق التحول بما في ذلك الضوابط عند تحويل باcteria المقدمة المختصة بأي طريقة. وهناك سيطرة سلبية تتكون من مجموعة من البكتيريا غير المختصة حولت مطلي على صفيحة أجار LB التي تحتوي على علامة انتقائية مساعدة بسرعة تحديد ما إذا كانت المضادات الحيوية على لوحة فعالة. وسوف تحول السيطرة الإيجابية مع إعداد البلازميد معروفة من نوعية جيدة وكمية إيواء نفس علامة انتقائية كما العينة التجريبية تكون مفيدة في تحديد ما إذا كانت البكتيريا هي المختصة ولكن أيضا ما إذا كان الحمض النووي التجريبية حولت كافية في كمية أو نوعية.
مزايا هذه التقنية هي متعددة؛ طريقة يمكن القيام بها خلال اليوم نفسه الذي يتم التخطيط لهذا التحول. لقد وجدنا أن الأسهم الجلسرين البكتيرية المجمدة قد تكون مطلية مباشرة على أجار LB دون أي خسارة في electrocompetence، ونحن قد فعلت ذلك في حالات "الطوارئ" (بعد نسيان لبدء الثقافة بين عشية وضحاها قبل يوم واحد). على الرغم من أننا لا يمكن أن اختبار البريدسلالة جدا معروفة، أي E. كولاي أو V. وكانت سلالة الكوليرا التي يمكن تحويلها من قبل التثقيب الكهربائي قابلة للهذا البروتوكول في أيدينا. تقنية سريع وفعال، وعوائد الكفاءة التحول مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من إعداد البكتيريا electrocompetent توظيف الطرق التقليدية. الأسلوب يلغي شرط للسرعة العالية الطرد المركزي والدوارات المرتبطة بها، شاكر حاضنة المدارية والدلاء الطرد المركزي معقمة (حاويات)، وكميات كبيرة من العازلة تعقيمها. على الرغم من أن جدول الكواشف محددة والمعدات شاملة تماما، فإن معظم المختبرات التي تنفذ التثقيب الكهربائي يكون معظم، إن لم يكن كل، هذه المواد متاحة بالفعل. ربما الأهم من ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة لتوليد سلالات مختبر محددة electrocompetent مع الخلفيات متحولة بسرعة. نحن لا علم له بأي قيود هذه التقنية لأنها حلت محل الطريقة التقليدية في إعداد كهربائيtrocompetent البكتيريا في مختبراتنا.
نفذت نتائج تجاربنا هو موضح هنا خارجا مع خلايا electrocompetent الطازجة المنتجة مع الطريقة التقليدية التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. ومع ذلك، والأسهم المجمدة خلية electrocompetent تفقد الكفاءة والجدوى أو على مدى فترات طويلة من التخزين. لدينا بروتوكول يسمح مختصرة إعداد الخلايا electrocompetent الطازجة في اليوم نفسه ومن المخطط التحول دون القلق بشأن عمر الأوراق المالية والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد المحولة. نحن لم حاولت تخزين الخلايا electrocompetent أنتجت باستخدام طريقة سريعة للاستخدام في يوم آخر لأن ذلك لم يكن ضروريا.
في حين لم تظهر هنا، وكفاءة الخلايا electrocompetent إعدادها باستخدام طريقتنا السريع كافية لمخاليط ربط. التحولات ذكرت لغير O1 V. الكوليرا في مقال نشر مؤخرا من قبل Unterweger وآخرون.وأجريت 17 من أصل باستخدام البكتيريا electrocompetent من خلال طريقة وصفها هنا (باستثناء تلك التي قامت بها الاقتران) أعدت. هذه التقنية تتيح للباحثين بتحويل سلالات متحولة مع الخلفيات بسرعة وفعالية دون الحاجة إلى إعداد دفعات كبيرة من الخلايا. يمكن تكييفها هذا التحضير السريع للبكتيريا طريقة electrocompetent إلى بدائيات النوى الأخرى التي ثبت أن تكون قابلة للالتثقيب الكهربائي من حيث المبدأ من إعداد والإعدادات التثقيب الكهربائي ستكون نفس تلك البروتوكولات التقليدية.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لزملائهم وموظفي المختبرات في الحاضر والماضي التي دعمت تطوير هذه التقنية. يتم اعتماد مختبر SP من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية غرانت التشغيل MOP-84473 وألبرتا حلول يبتدع الصحة (بتمويل من مؤسسة التراث ألبرتا للصندوق الهبات للبحوث الطبية). وأيد موانئ دبي من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MD001091-01-02 وGM068855.
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
| Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
| Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
| Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
| 13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
| 13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
| 6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
| Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
| Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
| Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
| Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
| Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
| Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
| Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
| LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
| Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |
Referanslar
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Taketo, A. DNA transfection of Escherichia coli by electroporation. Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).
- Fiedler, S., Wirth, R. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).
- O’Callaghan, D., Charbit, A. High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).
- Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation. Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).
- Grones, J., Turna, J. Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).
- Allen, S. P., Blaschek, H. P. Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).
- Belliveau, B. H., Trevors, J. T. Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).
- Chassy, B. M., Flickinger, J. L. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).
- Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).
- Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae. J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).
- Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).
- Aune, T. E., Aachmann, F. L. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).
- Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages. PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).
