Approcci genetici in avanti<em> Chlamydia trachomatis</em

Le intracellulare obbligato batterio Chlamydia trachomatis conti per una stima di 2,8 milioni di infezioni del tratto genitale ogni anno negli Stati Uniti (Center for Disease Control) con associata sequele come la malattia infiammatoria pelvica, gravidanze ectopiche e sterilità (1). Chlamydia spp hanno un unico fisiologia con un ciclo di sviluppo bifasico costituito da due forme: il corpo elementare infettiva ma non replicante (EB) e il corpo reticolato non infettiva ma replicativa (RB). Infezione inizia con l'attaccamento di EBS per cellule epiteliali seguite da endoctyotosis (2). All'interno di un vacuolo di membrana chiamato un'inclusione, EBS differenziarsi in forma RB, che poi si replica per scissione binaria. A metà ciclo, transizioni RBS nuovo in EBS, che vengono poi espulse nello spazio extracellulare di iniziare nuovi cicli di infezione quando i lisi della cellula ospite (3).

C. trachomatis èrefrattario alla manipolazione di routine con strumenti genetici molecolari standard, ad esempio la sostituzione mirata del gene, trasposoni, e fagi trasduttori, che sono stati al centro di molti studi di genetica batterica, non è chiaro in che misura i singoli geni Chlamydia contribuiscono alla evasione di immunità innata , l'acquisizione di nutrienti, le transizioni evolutive, o altri processi importanti per la sopravvivenza del patogeno all'interno di un ospite eucariotica (4). Di conseguenza, questo patogeno rimane poco caratterizzato, nonostante la sua importanza clinica.

I genomi di Chlamydia spp. sono relativamente piccole (~ 1 Mb) (5), con più specie e biotipi sequenziati usando Avanti tecnologie di sequenziamento generazione. Analisi genomica comparativa di WGS ha fornito intuizioni uniche nella evoluzione della specie Chlamydia e il loro adattamento per l'uomo (6-8) e in qualche misura ha fornito alcune informazioni circa la potenziale funzione di fattori di virulenza (9, 10). Tegli diversità genetica visualizzata da isolati clinici non fornisce la risoluzione richiesta per mappare sistematicamente la funzione della maggior fattori di virulenza, presumibilmente perché tali mutazioni in geni sarebbero stati prontamente contro selezionato. Senza effetti confondenti di selezione naturale, variazione del gene mutageno indotto, insieme con dosaggi definiti che i difetti misurano in virulenza, possono ampliare lo spettro di mutazioni che possono essere esaminati. Mutageni chimici, in particolare, sono utili in quanto possono generare null, condizionale, hypomorphic (ridotta funzione), e hypermorphic (guadagno di funzione) alleli. Con l'arrivo delle tecnologie di sequenziamento del genoma-robusti di prossima generazione, tali mutazioni possono essere facilmente identificati e mappati. In questo modo, le associazioni forti può essere fatta tra mutazioni in un gene o genetico percorso ed un fenotipo comune, consentendo l'applicazione di approcci genetici avanti.

Le sequenze del genoma dei ceppi clinici hanno rivelato mosaicismo bra sierotipi ei loci di ricombinazione frequente (11). L'evidenza empirica di ricombinazione è stata dimostrata attraverso la co-infezione di due diversi ceppi resistenti agli antibiotici e la selezione di progenie ricombinante resistente doppio, che si è rivelato di avere contributi genetici di entrambi i ceppi (12, 13). Così, scambio genetico tra ceppi wild type e mutanti in un ambiente co-infezione permette segregazione delle mutazioni indotti chimicamente per individuare il gene alterato che porta al fenotipo osservato.

Qui si descrive un metodo per effettuare analisi genetica in Chlamydia base di mutagenesi chimica, WGS, e un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate (14) (Figura 1).