Vorwärts Genetische Ansätze in<em> Chlamydia trachomatis</em

Die obligat intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis Konten für schätzungsweise 2,8 Millionen Genitaltrakt Infektionen pro Jahr in den Vereinigten Staaten (Center for Disease Control) mit assoziierten Folgeerkrankungen wie Adnexitis, ektope Schwangerschaften und Unfruchtbarkeit (1). Chlamydia spp haben eine einzigartige Physiologie mit einem zweiphasigen Entwicklungszyklus bestehend aus zwei Formen: die ansteckende, aber nicht-replizierenden elementaren Körper (EB) und der infektiösen aber replikativen reticulate Körper (RB). Infektion beginnt mit der Befestigung der EBs Epithelzellen durch endoctyotosis (2). Innerhalb einer membrangebundenen Vakuole bezeichnet eine Aufnahme, EBS in die RB Form, die dann repliziert durch binäre Spaltung unterscheiden. In der Mitte des Zyklus, RBs Übergänge zurück in EBs, die dann in den extrazellulären Raum ausgestoßen werden, um neue Runden der Infektion zu initiieren, wenn die Wirtszelle lysiert (3).

C. trachomatis istrefraktär Routinemanipulation mit Standard molekulargenetische Werkzeuge, wie gezielte Gen-Ersatz, Transposons und Transduzieren Phagen, die von zentraler Bedeutung für die meisten Studien in Bakteriengenetik haben, ist es unklar, in welchem ​​Umfang einzelne Chlamydia Gene tragen zur Umgehung der angeborenen Immunität , Nährstoff Erwerb, Entwicklung Übergänge oder andere Prozesse wichtig für das Überleben des Erregers in einem eukaryotischen Wirt (4). Folglich bleibt diese Erreger schlecht charakterisiert trotz ihrer klinischen Bedeutung.

Die Genome von Chlamydia spp. sind relativ klein (~ 1 Mb) (5) mit mehreren Arten und Biovare sequenziert mit Next Generation Sequencing-Technologien. Vergleichende Genomanalyse von WGS hat einzigartige Einblicke in die Evolution der Chlamydien-Arten und ihre Anpassung an den Menschen (6-8) und in gewissem Umfang zur Verfügung gestellt hat einige Informationen zur Verfügung gestellt, um das Potenzial in Abhängigkeit von Virulenzfaktoren (9, 10). Ter genetischen Vielfalt von klinischen Isolaten angezeigt nicht die Auflösung erforderlich ist, um systematisch Karte die Funktion der meisten Virulenzfaktoren, vermutlich, weil Mutationen in solchen Genen wäre leicht gegen ausgewählt haben. Ohne verwirrende Effekte aus natürlichen Selektion, erbgutverändernd-induced gene Variante mit definierten Tests, die Maßnahme Mängel in der Virulenz, das Spektrum von Mutationen, die befragt werden können, erweitern können gekoppelt. Chemische Mutagene, insbesondere, sind nützlich, da sie null, bedingten, hypomorphen (reduzierter Funktion) zu erzeugen, und hypermorphic (gain of function) Allele. Mit der Ankunft der robusten nächsten Generation Genom-Sequenzierung Technologien können solche Mutationen leicht identifiziert werden und kartiert. Auf diese Weise können starke Assoziationen zwischen Mutationen in einem Gen oder einer genetischen Weg und einem gemeinsamen Phänotyp gebildet werden, wodurch die Anwendung von Vorwärts genetische Ansätze.

Die Genomsequenzen von klinischen Stämmen offenbarte mosaicism bwischen Serovare und loci der häufigen Rekombination (11). Empirische Daten der Rekombination wurde durch Co-Infektion von zwei verschiedenen Antibiotika-resistenten Stämmen und Selektion resistenter Dual rekombinanten Nachkommenschaft, die offenbarte genetischen Beiträge von beiden Stämme (12, 13) nachgewiesen. Somit ermöglicht genetischen Austausch zwischen Wildtyp und Mutanten in einem Ko-Infektion Einstellung Trennung von chemisch induzierten Mutationen, die betroffene Gen, das den beobachteten Phänotyp führt zu lokalisieren.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese, WGS, und ein System für die DNA-Austausch innerhalb infizierter Zellen (14) (Abbildung 1) durchzuführen.