功能研究和过继转移实验小鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离，纯化及贴标

嗜中性粒细胞是人类最丰富的白细胞。他们是主要的先天免疫系统和抵御入侵的微生物的第一线作为细胞成分。获得性中性粒细胞减少症和原发性免疫缺陷的患者，影响中性粒细胞数量和/或功能的发展危及生命的侵袭性细菌和真菌感染，这些细胞在宿主防御¹突出的重要性。在一场精心策划的先天免疫反应，从而导致分泌趋化因子产生趋化梯度能够招募中性粒细胞从血液中进入发炎组织²诱导其同源的模式识别受体的结果入侵的病原体在感染部位的免疫识别。中性粒细胞进入感染部位后，他们成为激活，导致细胞因子和趋化因子的生产，病原体吸收，并通过氧化和非氧化我杀chanisms ^3。除了 ​​大家公认的先天免疫的作用，中性粒细胞也被最近表现出作为有效的适应性免疫反应的发起人，扮演着重要的角色。另一方面，从它们的免疫保护作用外，中性粒细胞也可介导组织损伤和由于过度积累和/或激活在炎症部位 ​​的免疫病理学，如图中的各种感染和自身免疫性疾病^5-7。

尽管中性粒细胞在安装有效的先天免疫反应和一些传染性疾病和炎症性疾病，技术上的困难，处理这些细胞，并缺乏可靠的实验协议的多效性效应功能不可或缺的作用受阻的研究，在过去的几十年里，中性粒细胞。因此，应进一步促进使用可重复的检测，隔离中性粒细胞中性粒细胞介导的​​immunolo研究gical功能体外和体内 。迄今为止，已经描述的几种方法已用于分离，如密度梯度离心的人血和小鼠血液或骨髓^8,9，正极或负极的从小鼠血液或骨髓^10,11中的嗜中性粒细胞的免疫磁性富集的嗜中性粒细胞，和收获巯基乙酸或其他抗炎剂¹²后，腹腔注射的小鼠的腹腔内中性粒细胞。虽然可以很容易地从人血中分离出大量中性粒细胞，这种方法是最理想的小鼠由于数量有限小鼠血液，排除隔离足够的中性粒细胞功能的研究或过继转移实验^13。此外，虽然产量的巯基乙酸盐诱导的腹膜腔中的细胞相比，小鼠血嗜中性粒细胞在炎症腹腔灌洗，纯度之间变化60-90％，分离出的嗜中性粒细胞，表现出一个激活的表型。因此，收集的细胞用这种方法只能用于执行功能的激活的研究，但并不代表未受刺激的嗜中性粒细胞，小鼠腹膜腔有中性粒细胞数，在稳定状态^12。相反，骨髓是一个方便的水库收获大量的任何未受刺激或激活的中性粒细胞^11,14，它可以被用于下游功能性研究，如吞噬作用，杀害和脱颗粒，或过继转移到受体小鼠。

在这里，我们介绍一个简单而快速的协议（约2小时），它提供了一个高收益率（〜6-12×10 ⁶中性粒细胞/未受感染的鼠标，或可达30-40×10 ⁶中性粒细胞/感染小鼠）纯（80 -95％）嗜中性粒细胞> 95％的存活率，从骨髓。此方法使用市售HISTOPAQUE，密度梯度细胞分离配给介质组成的聚蔗糖和泛影葡胺钠，分离从小鼠骨髓中的嗜中性粒细胞。此方法产生的显着更大的每只小鼠的嗜中性粒细胞的数目相比，血液或腹膜腔，它可以被用来收集在稳定状态或感染后的小鼠嗜中性粒细胞，它是比较容易的层相比，使用不连续的密度梯度离心法Percoll密度梯度组成的55％/ 65％/ 75％的Percoll ⁹在PBS中。此外，收集纯净的中性粒细胞所需的时间和资源相比显着下降，中性粒细胞隔离，利用荧光激活细胞分选。此外，因为这种方法不涉及免疫磁性富集步骤，更具成本效益的，它避免了细胞暴露磁性柱和抗体，从而减少中性粒细胞活化的可能性。

在除了执行功能隔离neutroph研究中ILS 体外和细胞过继转移到受体小鼠，该协议还描述了一种方法，用于标识分离的嗜中性粒细胞，使用不同的CellTracker染料。从不同遗传背景的小鼠中性粒细胞的鉴别标签跟踪转移的嗜中性粒细胞在受体小鼠的组织，采用流式细胞仪，它可以提供机械洞察力贩运中性粒细胞从血液中特定基因的直接作用，可适应在竞争激烈的复育研究进入靶器官发炎^6。