Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de mens. Zij zijn de belangrijkste cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Patiënten met verworven neutropenie en primaire immuundeficiënties dat neutrofielen nummers en / of functie beïnvloeden de ontwikkeling van levensbedreigende invasieve bacteriële en schimmelinfecties, met de nadruk op het belang van deze cellen in de afweer ^1. Immuunherkenning van binnendringende ziekteverwekkers op de infectieplaats door hun verwante patroonherkenning receptoren resulteert in de inductie van een georkestreerde aangeboren immuunreactie, wat leidt tot uitscheiding van chemoattractants een chemotactische gradiënt kan werven neutrofielen uit het bloed in ontstoken weefsel ² genereren . Na neutrofielen alstublieft de besmettingsplaats, worden ze geactiveerd, wat leidt tot cytokine en chemokine productie pathogeen opname en doden via oxidatieve en niet-oxidatieve mechanisms ^3. Naast hun goed-erkende rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen zijn ook onlangs aangetoond dat een belangrijke rol spelen als initiatiefnemers van effectieve adaptieve immuunreacties ^4. Anderzijds, los van hun beschermende rol in immuniteit, neutrofielen bemiddelen ook weefselschade en immunopathologie door overmatige accumulatie en / of activatie op plaatsen van ontsteking, zoals getoond in diverse infectieziekten en auto-immuunziekten ^5-7.

Ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de montage effectieve aangeboren immuunrespons en hun pleiotropische effector functies in diverse infectieziekten en ontstekingen, technische problemen met de behandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen heeft belemmerd onderzoek met een aantal neutrofielen in de afgelopen decennia. Daarom wordt gebruik van reproduceerbare assays voor isolatie van neutrofielen moet verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunolo vergemakkelijkengische functies ex vivo tr in vivo. Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen beschreven voor het isoleren van neutrofielen zoals dichtheidsgradiënt centrifugering van bloed en muis bloed of beenmerg ^8,9, positieve of negatieve immunomagnetische verrijking van neutrofielen van muizen bloed of beenmerg ^10,11 en oogsten van neutrofielen uit de peritoneale holte van muizen na intraperitoneale injectie van thioglycollaat of andere inflammatoire middelen ^12. Hoewel neutrofielen gemakkelijk afzonderlijk in grote aantallen uit menselijk bloed, deze methode niet optimaal bij muizen vanwege de beperkte hoeveelheid muizenbloed die isolatie voldoende neutrofielen voor functionele studies of adoptieve overdrachtsexperimenten ¹³ uitsluit. Bovendien, hoewel de opbrengst van thioglycollaat-opgewekte cellen van de peritoneale holte groter is vergeleken met die van muizenbloed, de zuiverheid van neutrofielen in de inflammatoire peritoneale lavage varieert60-90%, en de geïsoleerde neutrofielen vertonen een geactiveerde fenotype. Aldus, de cellen verzameld met deze methode alleen gebruikt voor het uitvoeren van functionele studies van geactiveerde, maar niet die van niet-gestimuleerde neutrofielen, zoals de muis peritoneale holte weinig neutrofielen bij het ​​stationaire ^12. In plaats daarvan, het beenmerg is handig reservoir voor het oogsten grote aantallen of ongestimuleerde of geactiveerde neutrofielen ^11,14, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse functionele studies zoals fagocytose en doden degranulatie of voor adoptieve overdracht in ontvangende muizen.

Een eenvoudige en snelle (~ 2 uur) protocol, dat een hoge opbrengst geeft Hierin beschrijven we (~ 6-12 x 10 ⁶ cellen / geïnfecteerde muis of tot 30-40 x 10 ⁶ cellen / geïnfecteerde muizen) zuiver (80 -95%) neutrofielen bij> 95% levensvatbaarheid van het beenmerg. Deze methode maakt gebruik van commercieel verkrijgbare Histopaque, die dichtheidsgradiënt cel separantsoen media bestaande uit Ficoll en natrium diatrizoaat te scheiden neutrofielen uit het beenmerg van muizen. Deze methode levert veel grotere aantallen neutrofielen per muis vergeleken met bloed of peritoneale holte, kan het worden gebruikt om neutrofielen ophalen muizen zowel steady state of na infectie, en het is gemakkelijker te laag ten opzichte van de dichtheidsgradiënt centrifugatie methode gebruikt discontinue Percoll gradiënt bestaande uit 55% / 65% / 75% Percoll in PBS ^9. Bovendien worden de tijd en de middelen om pure neutrofielen verzamelen significant verlaagd vergeleken met neutrofiel isolatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Ook, omdat deze methode geen sprake van een immuno verrijkingsstap is rendabeler en vermijdt de blootstelling van cellen aan de magnetische kolom en antilichamen, wordt de kans op neutrofiel activatie afneemt.

Naast het uitvoeren van functionele studies van geïsoleerde neutrophils ex vivo en adoptieve overdracht van cellen in de ontvangende muizen, dit protocol beschrijft ook een werkwijze voor het labelen van geïsoleerde neutrofielen met verschillende CellTracker kleurstoffen. Differentiële labeling van neutrofielen van muizen van verschillende genetische achtergronden kan worden aangepast in concurrerende herbevolking studies voor het bijhouden van de overgedragen neutrofielen in de weefsels van de ontvangende muizen met behulp van flowcytometrie, die mechanistisch inzicht kan verschaffen over de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doel ontstoken organen ^6.