passivation de surface pour les études de protéines unique molécule

1. Faites glisser Préparation et nettoyage Une chambre microfluidique est composé d'une lame de quartz et une lamelle couvre-objet. Dans de type prisme à réflexion totale fluorescence interne (TIRF) de la microscopie, la surface de la lame de quartz est imagé. Par conséquent, il est important de nettoyer une lame de quartz à fond en utilisant H 2 O, l'acétone, le KOH, et des solutions de piranha. Th est nettoyage multi-étape élimine les molécules organiques fluorescentes sur une surface qui interfèrent avec les mesures de fluorescence de la molécule unique. En outre, la gravure de piranha rend la surface hydrophile de quartz en générant des groupes hydroxyle. Les groupes hydroxyles libres sont essentiels pour la réaction amino-silanisation à l'étape 3. Diapositives forage de quartz. Percer une paire de trous dans une lame de quartz avec un peu de 3/4 mm de forage au diamant (Figure 2a). Si plusieurs canaux sont souhaitées, forer plus pairs de trous (Figure 2b). Ces trous sont utilisés pour l'injection de solutions dans une chambre microfluidique à l'étape 7. Conserver le trépan de forage humide à H 2 O au cours du forage. H 2 O se produit comme lubrifiant, ce qui augmente la durée de vie du trépan de forage. Occasionnellement essuyage de la pointe du foret permet de percer des trous. Après le perçage des trous, marquer un côté de la lame pour faciliter l'identification pendant le processus de PEGylation. Les marqueurs peuvent être utilisés comme référence pour éviter toute confusion plus tard. Pour le marquage, un bit de forage au diamant peut être utilisé. Ne pas utiliser de stylo depuis l'encre pourrait obtenir sur la surface. Nettoyage avec H 2 O. Placer les lames dans un pot de peinture sur verre. Typiquement, 5 à 15 diapositives peuvent être placés dans un seul pot. Rincer les lames avec MilliQ H 2 O. Répétez 3 fois et soniquer les diapositives avec MilliQ H 2 O pendant 5 minutes pour enlever la saleté. Jeter l'eau et rincer les lames à nouveau 3 fois avecMilliQ H 2 O. A noter que 130 W est la puissance de sonication utilisé pour ce protocole. Puissance de sonication plus élevée pourrait réduire la durée de vie des lames de quartz. Nettoyage avec de l'acétone. Remplacez le MilliQ H 2 O avec de l'acétone. Soniquer les lames avec de l'acétone pendant 20 min ou plus. Rinçage à l'H 2 O. Rejeter l'acétone et rincer les lames avec MilliQ H 2 O. Répétez 3 fois afin d'enlever tout résidu de l'acétone. Nettoyage avec KOH. Remplacer l'eau avec 1 M KOH et soniquer les diapositives de 20 minutes ou plus. Gravure excessive (par exemple la nuit de traitement de KOH) permettra d'améliorer la qualité de la surface, mais présentera des rayures, ce qui pourrait interférer avec l'imagerie de fluorescence. Rinçage à l'H 2 O. Rincer les lames avec MilliQ H 2 O 3 fois pour éliminer les traces de KOH. Piranha gravure. Placer les lames dans un support de diapositives Duran ou un titulaire de téflon sur mesure et place-les dans un bêcher (1 litre) qui se trouve dans une hotte chimique. Remplir le bécher avec 450 ml d'H 2 SO 4. Ajouter 150 ml d'H 2 O 2 à 03 heures 01 rapport entre H 2 SO 4 et H 2 O 2. Une fois la solution commence à bouillir spontanément, la température augmente de plus de 90 ° C. Assurez-vous que la solution H 2 O 2 est à la température ambiante avant de commencer la réaction. Dans le cas contraire, la température de la solution d'ébullition peut être inférieure à 90 ° C. Agiter la solution pour un bon mélange et laissez reposer pendant le bécher 20 min. Prenez les diapositives de la solution de piranha avec le support de diapositives, et les mettre dans un support de diapositives contenant MilliQ H 2 O. Pendant ce temps, jetez la solution piranha dans une bouteille de déchets désignés une fois qu'il atteint la température ambiante. Rincer les lames 3 fois avec MilliQ H 2 O. Un soin particulier doit être pris en outre steps pour éviter toute contamination possible des diapositives. Continuer à l'étape 3. Il est conseillé de procéder immédiatement aux étapes suivantes. * Attention: La solution de piranha est extrêmement réactif. Lors de la manipulation de cette solution prudence devrait être prise. En outre, lorsque, par erreur en mélange avec des solvants organiques tels que l'acétone, il peut provoquer une explosion. 2. Coverslip nettoyage Une chambre microfluidique est composé d'une lame de quartz et la lèvre de couverture. Lorsqu'un microscope TIRF de type prisme est utilisé, la surface d'une lamelle couvre-objet n'est pas imagée. Par conséquent, il suffit de nettoyer une lamelle couvre uniquement avec H 2 O et KOH. Dans le cas d'une lamelle couvre-objet doit être imagée (par exemple par l'intermédiaire de la microscopie TIRF du type à objectif), il est recommandé de traiter les lamelles avec une solution piranha (étape 1.7). Notez que si PEGylation de la surface de la lamelle n'est pas de haute qualité, il peut agir comme un puits pour les protéines d'und donner lieu à des variations de la concentration en protéines. Rinçage à l'H 2 O. Placer les lamelles (24 x 30, 24 x 40 ou 24 x 50 mm 2) dans un bocal de verre de coloration. Typiquement, 5 à 15 lamelles couvre-objet peuvent être placées dans un seul pot. Rincer les lamelles 3 fois avec le MilliQ H 2 O. Nettoyage avec KOH. Remplacer l'eau par du KOH 1 M et soniquer les lamelles pendant 20 minutes ou plus. Rinçage à l'H 2 O. Rincer les lamelles 3 fois avec de l'H 2 O MilliQ pour éliminer les traces de KOH. Passez à l'étape 3. 3. Amino-silanisation des lames et lamelles couvre- La fonctionnalisation de la surface des lames de quartz et les lamelles couvre-objet avec un groupe amine par l'intermédiaire de la chimie amino-silanisation. Le méthanol est utilisé comme solvant et l'acide acétique en tant que catalyseur pour la réaction amino-silanisation. Rinçage avec du methanol. Remplacez le MilliQ H 2 O dans les bacs de coloration (de Steps 1 et 2) avec du méthanol. Gardez les lames et les lamelles dans du méthanol avant l'étape 3.3. Ne pas stocker les lames et les lamelles dans du méthanol pour une inutilement longue période de temps (par exemple plusieurs heures) depuis impuretés dans le méthanol sera adsorber à la surface. Préparation solution d'amino-silanisation. Rincer un ballon en Pyrex plusieurs fois avec du methanol. Soniquer le flacon avec du methanol pendant 5 minutes, ou plus longtemps. Il est conseillé d'avoir un ballon dédié qui est maintenu propre. Verser 100 ml de methanol dans le ballon. Ajouter 5 ml d'acide acétique. Ajouter 3 ml de APTES (3-aminopropyltriméthoxysilane) et mélanger doucement en le secouant. Amino-silanisation. Remplacer le méthanol dans les bacs de coloration contenant les diapositives et les lamelles couvre-objet avec le mélange réactionnel d'aminosilanization. Incuber pendant 20-30 min. Pendant l'incubation, une fois sonication pendant 1 min. Rinçage avec du methanol. Remplacer la uneréaction de minosilanization avec du methanol. Écarter le méthanol et ajouter une solution de méthanol frais. Répétez cette procédure trois fois. 4. Passivation de surface en utilisant un polymère (premier tour) Passivation de la surface d'aminé revêtu de lames de quartz et des lamelles couvre-objet en conjuguant NHS-ester de polyéthylène glycol (PEG). Cette réaction est effectuée avec la concentration de saturation de la solution de PEG à pH 8,5 pendant une nuit. Séchage des diapositives et des lamelles. Sécher les lames et les lamelles couvre-objet à l'aide de N 2 gazeux et de les placer dans des boîtes de pipette propre d'une manière telle que le côté qui doit être pégylée est orientée vers le haut. La boîte de pipette est partiellement rempli avec MilliQ H 2 O. Ce milieu humide empêche solution de PEGylation de sécher pendant la nuit d'incubation. Préparation de tampon de réaction. Préparer 0,1 M de tampon frais de bicarbonate de sodium (pH 8,5) en dissolvant 84 mg de bicarbonate de sodium dans 10 ml d'MilliQ H 2 O. Il n'y a pas besoin d'ajuster le pH. Cette solution peut être conservé congelé pour la prochaine utilisation (par exemple de l'étape 6.1). Préparer une solution de PEGylation. Préparer un mélange de PEG de 0,2 mg biotinylés NHS-ester de PEG (5000 Da) et 13 8 mg de NHS-ester de mPEG (5000 Da) dans un tube de 1,5 ml. Lors de la préparation de N nombre de diapositives, la préparation de N fois plus grande quantité du mélange de PEG dans un seul tube. Ajouter 64 ul de N fois (ou 64 ul de N nombre de lames) de la mémoire tampon fraîchement préparé (étape 4.2). Introduire à la pipette de haut en bas afin de les dissoudre complètement. Centrifugeuse avec 16 100 g pendant 1 min pour éliminer les bulles d'air. Ne pas pipeter par la suite. Sinon, les bulles d'air se forment qui interfèrent avec la PEGylation à l'étape 4.4. PEGylation. Déposer 70 ul du mélange de PEGylation à une lame de quartz séché obtenu à l'étape 4.1. Utilisez 90 pi en cas de 24 x 50 mm 2 coverslip. Placez délicatement une lamelle séchée de l'étape 4.1 sur la solution. Pour avoir un uniforme et de haute qualité de PEGylation, prendre soin de ne pas introduire de bulles d'air. En raison de la tension superficielle, la plupart des bulles d'air peuvent spontanément laisser le volume de réaction dans les cinq minutes en raison de la tension superficielle. Incuber les lames dans un environnement sombre et humide. La demi-vie de NHS-ester que l'on utilise du PEG à un pH de 8 est d'environ une heure. Au minimum, les incuber pendant 2 heures. Incubation pendant une nuit conduit à la meilleure qualité de PEGylation (données non présentées). 5. Stockage à long terme Stockage des diapositives et des lamelles en N 2 PEGylés à -20 º C. Séchage des diapositives et des lamelles. Démonter délicatement la lame et la lamelle en faisant glisser la lamelle à un côté, les rincer à l'eau MilliQ H 2 O, et les sécher avec N 2. Stockage des diapositives et des lamelles. For une utilisation immédiate, suivez la procédure pour le second tour de PEGylation (étape 6). Afin de stocker pour une longue période de temps, suivre les étapes suivantes. Placer une paire de la lame et la lamelle couvre-objet dans un tube de 50 ml de telle sorte que les surfaces PEGylées sont confrontés à une distance l'une de l'autre. Fermer partiellement le tube, le tube sous vide, puis le remplir avec N 2. Ces étapes permettent de préserver la surface pégylé pendant une longue période de temps. Visser hermétiquement le tube et le stocker à -20 ° C. La qualité des lames reste bonne pour 3 mois (Figure 3a, à droite). 6. Passivation de surface en utilisant un polymère (le second tour) Série supplémentaire de PEGylation pour rendre la couche plus dense de PEG et également pour étancher tous les groupes amine qui restent sur ​​la surface. L'utilisation de courts molécules NHS-ester de PEG (333 Da) peut être efficace en pénétrant dans une couche de PEG existant. Il est recmandé de faire de ce second tour de PEGylation droit avant d'utiliser une diapositive. Préparation de tampon de réaction. Préparer 0,1 M de tampon frais de bicarbonate de sodium (pH 8,5). La solution congelée de l'étape 4.2 peut aussi être utilisé. Préparer une solution de PEGylation. Dissoudre 7 ul de 250 mM MS4-PEG dans 63 ul du tampon de bicarbonate de sodium. PEGylation. Suivez la même procédure que dans l'étape 4.4. Incuber pendant 30 min jusqu'à la nuit. Séchage des diapositives et des lamelles. Démonter la paire de la lame et la lamelle, rincez-les avec MilliQ H 2 O, les sécher avec N 2, et de les conserver dans une boîte de pipette propre. Procéder à l'assemblage d'une chambre microfluidique à l'étape 7. 7. Assemblage une chambre microfluidique Assemblage d'une chambre microfluidique en utilisant une paire d'une lame de quartz pégylé et une lamelle couvre-objet. Ruban adhésif double face collante est utilisé comme une entretoise. La chambre est scellé avec de la colle époxy et, silutions sont introduits à travers les trous de la lame de quartz. Placer une lame de quartz sur une surface plane avec le côté orienté vers le haut pégylé. Faites un canal (largeur de 5 à 7 mm) en diagonale sur la surface pégylé en mettant rubans adhésifs double face collante sur la lame. Assurez-vous que les trous sont positionnés au centre du canal. Prenez soin de ne pas abîmer la surface pégylé pendant le processus de fabrication d'une chambre. Il est possible de réaliser une glissière à canaux multiples en plaçant et en collant les bandes adhésives double face différente (voir figure 2). Placez délicatement une lamelle pégylé sur le dessus pour compléter la chambre. Le côté pégylé doit être orientée vers le bas. Étanchéité de la chambre en appuyant sur la lamelle sur la zone où rubans adhésifs double face sont placés. Faites-le doucement mais complètement de sorte que la chambre se transforme en eau-étanche. Fermer les bords de la chambre avec de la colle époxy. Immobiliser streptavidine ou neutravidine sur laPEG biotinylé couche en ajoutant 50 ul de 0,1 mg / ml de solution de streptavidine ou de neutravidine à T50 (10 mM Tris-HCl, tampon mM de NaCl [pH 8,0] 50) à l'aide d'une pipette de p200. Après 1 min d'incubation, rincer avec 100 pi de tampon T50. Ajouter molécules biologiques biotinylés pour votre imagerie seule molécule. 8. Faites glisser le recyclage Recyclage des lames de quartz. Diapositives utilisées sont recyclées en enlevant les lamelles et les rubans adhésifs double face collante. Après utilisation, stocker les chambres dans l'eau du robinet. Incubation à long terme dans l'eau facilite le démontage des chambres. Faire bouillir les chambres dans l'eau du robinet à l'aide d'un micro-ondes. Utilisez un bécher en Pyrex. Faire bouillir pendant 10 minutes ou plus. Enlevez les lamelles et les bandes adhésives double face en utilisant une lame de rasoir. Ne pas appuyer sur une lame de quartz perpendiculaire à son plan. Sinon, il se casse. Garder la lame de rasoir à une distance à partir du canal. Otherwise, il introduit les rayures sur le canal. Rincer les lames à l'aide d'un détergent ménager en les frottant avec les doigts. Placer les lames dans un pot de peinture sur verre. Typiquement, 5 à 15 diapositives peuvent être placés dans un seul pot. Ajouter 10% de détergent ménager et soniquer les diapositives de 20 minutes ou plus. Rincer les lames avec une grande quantité de l'eau du robinet. Passez à l'étape 1.2.