Oppervlaktepassivering voor Single-molecule Protein Studies

1. Schuif het bereiden en schoonmaken Een microfluïdische kamer bestaat uit een kwarts glijbaan en een dekglaasje. In prisma-achtige totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, is het oppervlak van het kwarts dia afgebeeld. Daarom is het belangrijk om een kwarts dia grondig met H2O, aceton, KOH en piranha oplossingen reinigen. Th is multi-step reiniging elimineert fluorescerende organische moleculen op een oppervlak die interfereren met 'single molecule fluorescentie metingen. Bovendien Piranha etsen maakt het kwartsoppervlak hydrofiele door het genereren van hydroxylgroepen. De vrije hydroxylgroepen zijn essentieel voor de amino-silaneren reactie in stap 3. Boren kwarts dia's. Boor een paar gaten in een kwarts dia met een 3/4 mm diamant boor (Figuur 2a). Als er meerdere kanalen zijn gewenst, boren meer pairs gaten (Figuur 2b). Deze gaten worden gebruikt voor het injecteren van oplossingen in een microfluïdische kamer in stap 7. Houd de boor beetje nat in H 2 O tijdens het boren. H2O presteert als een smeermiddel, waarbij de levensduur van de boor toeneemt. Af en toe af te vegen de punt van de boor helpt het boren van gaten. Na het boren gaten markeren een zijde van de schuif voor gemakkelijke identificatie tijdens het PEGylatie proces. De markers kunnen worden gebruikt als referentie om verwarring te vermijden later. Voor het markeren, kan een diamant boor worden gebruikt. Gebruik geen pen niet, omdat de inkt zou kunnen krijgen op het oppervlak. Reinigen met H 2 O. Plaats de dia's in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 slides in een pot geplaatst. De dia's spoelen met MilliQ H 2 O. Herhaal dit 3 keer en ultrasone trillingen de dia's met MilliQ H 2 O 5 minuten om vuil te verwijderen. Gooi het water en spoel de glaasjes weer 3 keer metMilliQ H 2 O. Merk op dat 130 W is de ultrasoonapparaat macht gebruikt voor dit protocol. Hogere macht sonificeren zou de levensduur van de kwarts dia's te verlagen. Reinigen met aceton. Vervang de MilliQ H 2 O met aceton. Ultrasone trillingen de dia met aceton gedurende 20 minuten of langer. Spoelen met H2O Gooi de aceton en spoel de glaasjes met MilliQ H 2 O. Herhaal dit 3 keer om eventuele aceton te verwijderen. Reinigen met KOH. Vervang het water met 1 M KOH en ultrasone trillingen de dia's voor 20 minuten of langer. Overmatige etsen (bijvoorbeeld 's nachts KOH behandeling) de kwaliteit van het oppervlak verbeteren, maar zal krassen, storende fluorescentie beeldvorming voeren. Spoelen met H2O Spoel de glaasjes met MilliQ H 2 O voor 3 keer om sporen van KOH verwijderen. Piranha etsen. Breng de dia's naar een dia houder Duran of een op maat gemaakte teflon houder en place ze in een bekerglas (1 L) die zich in een chemische kap. Vul het bekerglas met 450 ml H 2 SO 4. Voeg 150 ml H 2 O 2 voor 03:01 verhouding H 2 SO 4 en H 2 O 2. Zodra de oplossing begint spontaan koken, de temperatuur stijgt boven 90 ° C. Controleer of de H2O 2 oplossing bij kamertemperatuur voordat de reactie. Anders kan de temperatuur van de kokende oplossing lager dan 90 ° C. Roer de oplossing voor een goede menging en laat de beker ongestoord gedurende 20 minuten. Neem de dia's uit de piranha-oplossing samen met de diahouder, en leg ze in een dia houder met MilliQ H 2 O. Ondertussen gooi de piranha oplossing in een aangewezen afvalfles zodra het op kamertemperatuur. Spoel de schuiven 3 maal met MilliQ H2O Extra zorg moet worden genomen bij de verdere steps om eventuele besmetting van dia's te voorkomen. Ga door naar stap 3. Het is aangeraden om direct door te gaan met de volgende stappen. * Let op: De piranha oplossing is uiterst reactief. Bij het hanteren van deze oplossing extra voorzichtigheid in acht moet worden genomen. Bovendien, wanneer per ongeluk gemengd met organische oplosmiddelen zoals aceton, kan een explosie veroorzaken. 2. Coverslip Cleaning Een microfluïdische kamer bestaat uit een kwarts glijbaan en cover s rand. Wanneer een prisma-achtige TIRF microscoop wordt gebruikt, wordt het oppervlak van een dekglaasje niet afgebeeld. Daarom is het voldoende om een dekglaasje alleen schoon met H2O en KOH. In het geval moet een dekglaasje af te beelden (bijv. via de doelstelling type TIRF microscopie), is het raadzaam om de dekglaasjes behandelen met piranha-oplossing (stap 1.7). Merk op dat als PEGylering van het dekglaasje oppervlak is niet van hoge kwaliteit, kan het fungeren als een gootsteen voor eiwitten eend leiden tot variaties in de eiwitconcentratie. Spoelen met H2O Plaats dekglaasjes (24 x 30, 24 x 40 of 24 x 50 mm 2) in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 dekglaasjes in een enkele pot geplaatst. Spoel de dekglaasjes 3 keer met de MilliQ H 2 O. Reinigen met KOH. Vervang het water met 1 M KOH en ultrasone trillingen de dekglaasjes 20 minuten of langer. Spoelen met H2O Spoel de dekglaasjes 3 maal met MilliQ H2O om sporen KOH verwijderen. Ga door naar stap 3. 3. Amino-silanisatie van Dia's en Coverslips Functionaliseren het oppervlak van het kwarts dia en dekglaasjes met aminegroep via de amino-silanisatie chemie. Methanol wordt gebruikt als oplosmiddel en azijnzuur als katalysator voor de amino-silanisatie reactie. Spoelen met methanol. Vervang de MilliQ H 2 O in de kleuring gerechten (van STEP 1 en 2) met methanol. Houd de dia's en de dekglaasjes in methanol tot stap 3.3. Laat de dia's en de dekglaasjes in methanol niet te slaan voor een onnodig lange periode (bijvoorbeeld enkele uren) sinds onzuiverheden in methanol zal adsorberen aan het oppervlak. Voorbereiden van amino-silanisatie oplossing. Spoel een Pyrex kolf meerdere malen met methanol. Ultrasone trillingen de kolf met methanol gedurende 5 minuten of langer. Het is aangeraden om een ​​speciale fles die schoon wordt gehandhaafd hebben. Giet 100 ml methanol in de kolf. Voeg 5 ml azijnzuur. Voeg 3 ml APTES (3-aminopropyltrimethoxysilaan) en meng door schudden. Amino-silanisering. Vervang de methanol in de kleuring gerechten die de dia's en de dekglaasjes met de aminosilanization reactiemengsel bevatten. Incubeer gedurende 20-30 minuten. Tijdens incubatie ultrasone trillingen eens 1 minuut. Spoelen met methanol. Vervang de eenminosilanization reactie met methanol. Gooi de methanol en voeg een verse methanol oplossing. Herhaal deze procedure drie keer. 4. Oppervlaktepassivering behulp Polymer (de eerste ronde) Passiveren het amine beklede oppervlak van kwarts dia's en dekglaasjes door conjugeren NHS-ester polyethyleenglycol (PEG). Deze reactie wordt uitgevoerd met de verzadigingsconcentratie van PEG-oplossing bij pH 8,5 gedurende de nacht. Drogen dia's en dekglaasjes. Droog de ​​objectglaasjes en dekglaasjes met N2-gas en plaats ze in schone pipet vakken zodanig dat de zijde die moet worden gePEGyleerd naar boven. De pipet box is gedeeltelijk gevuld met MilliQ H2O Deze vochtige omgeving voorkomt PEGylation oplossing uitdrogen tijdens de nachtelijke incubatie. Het voorbereiden reactie buffer. Bereid 0,1 M vers natriumbicarbonaat buffer (pH 8,5) door het oplossen van 84 mg van natriumbicarbonaat in 10 mlMilliQ H2O Het is niet nodig de pH. Deze oplossing kan bevroren worden opgeslagen voor het volgende gebruik (bijv. stap 6.1). Het voorbereiden PEGylering oplossing. Bereid een PEG mengsel van 0,2 mg gebiotinyleerd NHS-ester PEG (5000 Da) 13 en 8 mg NHS-ester mPEG (5000 Da) in een 1,5 ml buis. Bij de voorbereiding van N aantal dia's, bereiden N keer grotere hoeveelheid van de PEG mengsel in een enkele buis. Voeg 64 ul (of N tijden 64 ul voor N aantal dia's) van de vers bereide buffer (Stap 4.2). Pipet op en neer om ze volledig op te lossen. Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 1 minuut om luchtbellen te verwijderen. Niet achteraf pipet. Anders zal luchtbellen die interfereren met PEGylation bij stap 4.4. PEGylering. Drop 70 pl van de PEGylatie mengsel tot een droge kwarts dia uit stap 4.1. Gebruik 90 ul bij 24 x 50 mm 2 coverslip. Plaats voorzichtig een gedroogde dekglaasje van Stap 4.1 over de oplossing. Om een ​​uniforme en hoge kwaliteit van PEGylation hebben, zorgen voor luchtbellen in te voeren. Door oppervlaktespanning, de meeste van de luchtbellen spontaan het reactievolume verlaat binnen vijf minuten door oppervlaktespanning. Incubeer de glaasjes in een donkere en vochtige omgeving. De halfwaardetijd van NHS-ester PEG die we bij pH 8 is ongeveer een uur. Minstens, incubeer ze gedurende 2 uur. Overnacht incubatie leidt tot hogere kwaliteit van PEGylatie (gegevens niet getoond). 5. Lange-termijn opslag De gepegyleerde dia's en dekglaasjes in N 2 Magazijn bij -20 º C. Drogen dia's en dekglaasjes. Demonteer voorzichtig de glijbaan en het dekglaasje door te schuiven het dekglaasje naar een kant, spoel ze af met MilliQ H 2 O, en droog ze af met N2. Opslaan glijbanen en dekglaasjes. For onmiddellijk gebruik, volgt u de procedure voor de tweede ronde van PEGylering (stap 6). Om voor een langere periode van tijd, volg dan de volgende stappen. Plaats een paar van de glijbaan en het dekglaasje in een 50 ml buisje, zodanig dat de gePEGyleerde oppervlakken afgekeerd van elkaar. Gedeeltelijk sluit de buis, vacuüm de buis, en vul het vervolgens met N2. Deze stappen helpen behouden gePEGyleerde oppervlakte voor een lange tijd. Schroef de slang stevig vast en bewaar bij -20 ° C. De kwaliteit van de dia's blijft goed voor maximaal 3 maanden (figuur 3a, rechts). 6. Oppervlaktepassivering behulp Polymer (de tweede ronde) Extra ronde van PEGylering aan de PEG-laag dichter te maken en ook om eventueel achtergebleven amine groepen op het oppervlak te lessen. Het gebruik van korte NHS-ester PEG-moleculen (333 Da) effectief kan zijn bij het ​​doordringen in een bestaande PEG laag. Het is recaan te raden een tweede ronde van PEGylering doen vlak voor het gebruik van een glijbaan. Het voorbereiden reactie buffer. Bereid 0,1 M vers natriumbicarbonaat buffer (pH 8,5). De bevroren oplossing van stap 4.2 kan worden gebruikt. Het voorbereiden PEGylering oplossing. Los 7 pi 250 mM MS4-PEG in 63 pl natrium bicarbonaat buffer. PEGylering. Volg dezelfde procedure als in stap 4.4. Incubeer gedurende 30 minuten tot 's nachts. Drogen dia's en dekglaasjes. Demonteer het paar van de glijbaan en het dekglaasje, spoel ze met MilliQ H 2 O, droog ze met N2, en bewaar ze in een schone pipet doos. Doorgaan voor het samenstellen van een microfluïdische kamer in stap 7. 7. Samenstellen Microfluidic Kamer Het samenstellen van een microfluïdische kamer met behulp van een paar van een gepegyleerde kwarts glijbaan en een dekglaasje. Dubbelzijdig plakband wordt gebruikt als een spacer. De kamer wordt afgesloten met Epoxy lijm en, zolossingen worden ingebracht door de gaten in de kwarts dia. Plaats een kwarts dia op een vlakke ondergrond met de gepegyleerde zijde naar boven. Maak een kanaal (breedte 5-7 mm) diagonaal op de gepegyleerde oppervlak door er dubbelzijdige kleverige tapes over de glijbaan. Zorg ervoor dat de gaten zich in het midden van het kanaal. Verzorgen de PEGylated oppervlak niet te verwennen tijdens het proces van het maken van een kamer. Het is mogelijk om een multi-channel slide te maken door het plaatsen van en het steken van de dubbelzijdige kleverige tapes anders (zie figuur 2). Plaats voorzichtig een PEGylated dekglaasje op de top om de kamer te voltooien. De gepegyleerde zijde moet naar beneden. Sluit de ruimte af door op de dekglaasje over het gebied waar de dubbelzijdige tapes worden geplaatst. Doe het grondig, maar voorzichtig, zodat de kamer wordt water-goed afgesloten. Sluit de randen van de kamer met epoxylijm. Immobiliseren Streptavidin of neutravidine op degebiotinyleerd PEG laag door toevoeging van 50 pi 0,1 mg / ml streptavidine of neutravidine oplossing T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl buffer) met een p200 pipet. Na 1 min incubatie, spoelen met 100 ul buffer T50. Voeg gebiotinyleerde biologische moleculen voor uw single-molecule beeldvorming. 8. Schuif Recycling Recycling kwarts dia's. Gebruikte dia's worden gerecycled door te nemen uit de dekglaasjes en de dubbelzijdige kleverige tapes. Na gebruik, bewaar de kamers in leidingwater. Langdurige incubatie in het water vergemakkelijkt demontage van de kamers. Kook de kamers in leidingwater met behulp van een magnetron. Gebruik een Pyrex beker. Kook gedurende 10 minuten of langer. Haal de dekglaasjes en de dubbelzijdige kleverige tapes met behulp van een scheermesje. Druk niet op een quartz dia loodrecht op zijn vlak. Anders, het breekt. Houd het scheermesje uit de buurt van het kanaal. Otherwise, introduceert krassen op het kanaal. Spoel de glaasjes met een allesreiniger door wrijven ze met de vingers. Plaats de dia's in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 slides in een pot geplaatst. Voeg 10% afwasmiddel en ultrasone trillingen de dia's voor 20 minuten of langer. De dia's spoelen met een grote hoeveelheid kraanwater. Ga naar stap 1.2.