A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Benjamin D. Weger; Meltem Weger; Nicole Jung; Christin Lederer; Stefan Br&#228;se; Thomas Dickmeis

doi:10.3791/50439

JoVE Journal > Biology

Biyoloji

A Triagem procedimento químico para Glucocorticoid Sinalização com um Sistema Reporter Zebrafish Zergling luciferase

Published: September 10, 2013

doi:

10.3791/50439

Benjamin D. Weger¹, Meltem Weger¹, Nicole Jung², Christin Lederer¹, Stefan Bräse^1,3, Thomas Dickmeis¹

¹Institute of Toxicology and Genetics,Karlsruhe Institute of Technology – Campus North, ²Institute of Organic Chemistry,Karlsruhe Institute of Technology – Campus North, ³Institute of Organic Chemistry,Karlsruhe Institute of Technology – Campus South

Özet

Descreve-se o processo e análise de dados de um sistema de triagem química para sinalização glicocorticóide hormônio do estresse utilizando larvas do peixe: o Responsive In vivo Zebrafish luciferase atividade (grizly) ensaio de glicocorticóides. O ensaio com sensibilidade e especificamente detecta efeitos na sinalização glicocorticóide por compostos que requerem metabolização ou afectam a produção de glucocorticóide endógeno.

Abstract

Hormonas de stress glicocorticóides e seus derivados artificiais são amplamente utilizadas drogas para o tratamento de inflamação, mas um tratamento a longo prazo com glucocorticóides pode levar a efeitos colaterais graves. Os sistemas de ensaio são necessários para pesquisar novos compostos que influenciam a sinalização de glucocorticóide in vivo ou para determinar os efeitos indesejados dos compostos sobre a via de sinalização de glucocorticóides. Nós estabelecemos um ensaio zebrafish transgênicos que permite a mensuração da atividade de sinalização glicocorticóide in vivo e em tempo real, o ensaio grizly (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish luciferase atividade). O ensaio baseado luciferase detecta efeitos na sinalização glicocorticóide com elevada sensibilidade e especificidade, incluindo os efeitos de compostos que requerem metabolização ou afectam a produção de glucocorticóide endógeno. Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a realização de telas químicas com este ensaio. Descrevemos aquisição de dados, normalização eanálise, colocando o foco no controle de qualidade e visualização de dados. O ensaio fornece, resolvida no tempo, e quantitativa uma leitura simples. Pode ser operado como uma plataforma independente, mas também é facilmente integrado de alto rendimento fluxos de trabalho de triagem. É, além disso, permite muitas aplicações além triagem química, tais como monitoramento ambiental de disruptores endócrinos ou investigação stress.

Introduction

Os glicocorticóides (GCs) são hormônios esteróides produzidos pela glândula adrenal, que desempenham um papel importante durante a resposta ao estresse e na regulação do metabolismo ^1. GC se ligam receptores de glucocorticóides citoplasmáticos (GRS) da superfamília de receptores nucleares, que, após a ligação, se translocam para o núcleo ^2. Aqui, eles podem, por exemplo, reprimir a transcrição por interferir com outros fatores de transcrição (transrepressão) ou ativar a transcrição gênica via elementos glicocorticóides resposta (Gres, transativação). Devido às suas propriedades anti-inflamatórias, os GCs ambos naturais e artificiais são amplamente utilizados medicamentos no tratamento de um número de doenças, tais como asma ou artrite ^3. No entanto, especialmente o uso a longo prazo de GCs pode produzir efeitos secundários graves, incluindo a diabetes e glaucoma ^4. Portanto, novos compostos visando GC sinalização com potencialmente mais benéfico eficiência do tratamento e tolerância são muito procurados popaer. Mais importante, os efeitos do ligando observados em culturas de células pode ser diferente da observada in vivo ^5. Tais efeitos podem distorcer os resultados obtidos com a cultura de células de ensaios de rastreio convencional baseado farmacêuticas. Química in vivo triagem como habilitado pelo modelo de zebrafish entrou recentemente em foco, uma vez que permite a determinação de efeitos não detectáveis em cultura de células ^6,7.

Vias de sinalização hormonais também podem ser afetados por poluentes ambientais. Os chamados desreguladores endócrinos (EDC) afetam vários processos hormonais regulados ^8. Assim, a reprodução sexual e diferenciação de organismos aquáticos que podem ser moduladas por substâncias com actividades semelhantes ao estrogênio. Recentemente, surgiram receios de que os distúrbios metabólicos podem estar ligados aos desreguladores endócrinos no meio ambiente ^9. Uma via de alvo de tais "perturbação metabólica" é a via de glucocorticóides, que também tem sido implicado em xenobióticos efeitos sobre o desenvolvimento e função imunológica ^10,11. No entanto, em comparação com a grande quantidade de informações disponíveis sobre compostos que interferem com a ação do hormônio esteróide sexual, pouco se sabe sobre os efeitos de desregulação endócrina mediadas através da GR. Portanto, são necessárias ferramentas que permitem monitorar os efeitos de poluentes na sinalização GC in vivo.

O peixe-zebra tem sido um modelo popular na biologia do desenvolvimento e, mais recentemente, também tem atraído pesquisadores de outras áreas, incluindo endocrinologia ^12. Em comparação com outros teleósteos, o sistema de sinalização de GC de peixe-zebra é mais semelhante ao de mamíferos, uma vez que o genoma do peixe-zebra contém apenas um gene GR, em oposição aos receptores repetido em muitas outras espécies de peixes ^13-15. Além disso, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal já é funcional em 5 dias de idade larvas do peixe, o que aumenta a produção de GC endógeno em resposta a factores de stress ^14,16-18.

Geramos recentemente uma linhagem transgênica peixe-zebra, GRE: Luc, o que permite o monitoramento da atividade de sinalização GC in vivo e em tempo real, ^18. A linha transporta uma construção de gene repórter de luciferase sob o controlo de um promotor mínimo de caixa TATÁ e quatro GRE concatemerized (Figura 1a). GC bioluminescência induzida pode ser medido a partir único GRE: larvas de Luc em 96 placas de microtitulação Bem in vivo durante períodos prolongados de tempo. Este ensaio grizly (para "Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish luciferase atividade") pode ser usado em um número de diferentes campos de pesquisa, como a investigação stress, monitoramento ambiental, e as telas farmacológicas ^18. Fomos capazes de detectar a origem endógena do cortisol após estresse osmótico do único larvas e poderia seguir a maturação da resposta durante o desenvolvimento. Além disso, podemos monitorar os efeitos sobre a sinalização de GC organoestânicos que requerem metabolização pela larva. É importante ressaltar que a linha foi capaz de detectar esses efeitos em concentrações ambientalmente relevantes. Finalmente, em uma tela de piloto do ensaio com sensibilidade e especificamente detectados compostos com actividade de GC de uma biblioteca química, incluindo um composto que estimula a produção endógena de cortisol nas larvas. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para telas químicas utilizando o ensaio grizly.

Protocol

1. Prepare diluição de trabalho de Biblioteca Química Pré-diluir os compostos da biblioteca de droga a ser testada (por exemplo, drogas aprovadas pela FDA, ENZO Life Science) em E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM de CaCl2) com um líquido robótico estação de manuseamento (por exemplo, Multiprobe II, 8 agulhas com adaptador de ponta disposição, PerkinElmer). As concentrações adequadas são, por exemplo 40 ug / ml em 3% de DMSO, mas isto dependerá do tipo de biblioteca utilizada. As configurações Multiprobe II correspondentes aos passos descritos abaixo são indicadas na Tabela 1. O protocolo descrito no quadro permite a preparação de quatro placas de alíquotas em paralelo. Pipetar 10 mL alíquotas da biblioteca de estoque (2 mg / ml em DMSO) em placas de poços profundos (por exemplo, placa de 96 cavidades de armazenamento, bem redondo, 0,8 ml, Abgene). As colunas 1 e 12 devem ser deixados vazios – estes irão receber os controlos positivos e negativos dentro da placa. <l i> Dispensar 490 ul de E3 com 1% de DMSO em alíquotas preparadas da biblioteca com o Multiprobe II. A diluição é feita com agulhas fixas sem a ponta de eliminação. Adicionar 10 ml de DMSO na coluna 1 e 10 ul de uma solução 5 mM de dexametasona (em DMSO) para a coluna 12, tal como controles dentro da placa. A concentração de DMSO em todos os poços e é agora a 3%, a concentração de dexametasona nos poços de controlo positivo é de 100 uM em E3 / 3% de DMSO. Selar a placa com folhas adesivas de vedação DMSO resistente. Armazenar as placas à temperatura de -80 ° C até utilização. 2. Criação de peixes Reporter Coletar embriões de desova natural de acasalamentos grupo entre GRE: peixes Luc transgênico. Levante embriões (não mais de 60), em 9 centímetros placas de Petri contendo meio E3 suplementado com 1 mg / ml de azul de metileno fungicida até 4 dias após a fertilização (dpf) em estufa a 28 ° C. Mude meio E3 regularmente. título "> 3. Preparação de Luciferase Médio (E3L) Prepara-se uma solução estoque de luciferina aquosa de 50 mM, por adição de dH2O para o frasco que contém o pó de luciferina. Esta solução pode ser armazenada a -80 ° C durante vários meses. Dilui-se o estoque de luciferina para meio E3 para uma concentração final de 0,5 mM, para se obter meio E3L. 4. Distribuir larvas em placas de 96 poços Prepare uma dicas ml de pipeta com furo grande, cortando cerca de 5 mm de ponta e brevemente flamejante as bordas afiadas. Larvas de piscina de vários cruzamentos por cuidadosamente vertendo-os a partir dos pratos de Petri para um copo. Colheita de cerca de 50 larvas de cada vez por suavemente vertendo-os para um crivo (tamanho do poro de 0,25 mm de diâmetro) e colocar imediatamente a peneira numa pequena placa de Petri (diâmetro de 5,5 cm) cheia com o fluido E3L. Com uma ponta de largura furo pipeta, transferir 225 ul de meio contendo uma larva de cada um dos poços de brancoPlaca de 96 poços (OptiPlate, PerkinElmer). Selar as placas com folhas de vedação adesivo (por exemplo, TopSeal-A, PerkinElmer) e incubar a 28 ° C durante a noite. Este pré-incubação evita a gravação de alterações transientes na bioluminescência imediatamente após a adição de luciferina, um fenómeno que ocorre também em células de cultura 19. 5. Tratamento Medicamentoso Remova a placa que contém a diluição de trabalho da biblioteca do freezer -80 ° C a cerca de 4 horas antes da utilização. Suavemente vortex a placa brevemente e girá-lo numa centrífuga para recolher o líquido, na parte inferior da placa. Retire as folhas adesivas de vedação das placas de larvas. Com um dispositivo de pipetagem de 96 canais operado manualmente (por exemplo, liquidante, Steinbrenner) pipetar a solução de drogas cima e para baixo 3 vezes. Então aliquota de 25 ul da diluição de trabalho da biblioteca química para os poços que contêm as larvas (com o exemplo acima, istoresulta numa concentração final de 4 ug / ml em E3 com 0,3% de DMSO). Preparar 10 (mínimo: 5) placas de réplicas com larvas por placa biblioteca. Selar as placas com as folhas de vedação adesivos e etiquetar cada prato com uma etiqueta de código de barras. 6. Gravação de luminescência Colocar as placas contendo as larvas para as unidades de empilhamento de um leitor de bioluminescência EnVision com maior sensibilidade luminescente (PerkinElmer). Em alternativa, usar um sistema robotizado incubadora tais como aqueles utilizados para sistemas de rastreio de cultura de células de mamíferos, em combinação com o leitor. Ficha de bioluminescência durante dois dias, utilizando as definições do leitor análogos aos descritos na Tabela 2 para o leitor EnVision. Adaptar o número de repetições do ensaio para o número de placas na execução para coincidir com o tempo de funcionamento necessário. Após o fim da corrida, verifique as placas para a presença de larvas mortas para avaliar a toxicidade geral da miniaturaounds. 7. Análise de Dados Toda a análise de dados é realizada no ambiente de programação estatística R usando scripts personalizados. Cálculo AUC A fim de identificar compostos activadores de GC de sinalização, independentemente das suas propriedades cinéticas, determinar a área sob a curva (AUC) dos traços de luminescência gravadas (contagens matérias bioluminescência versus tempo), como o parâmetro de despistagem. AUC são aproximadas com a regra trapezoidal (ver Figuras 2A e a '). Normalização Log transformar os valores de AUC, a fim de garantir uma maior normalidade dos dados (Figuras 2b e b '). Em seguida, normalizar os log transformado valores da AUC para cada placa de biblioteca com o método Z-score robusto (ver 20). Esta normalização resulta em valores que representam o número de desvios padrão a partir da média de todos os pontos de dados. Desta forma,erros sistemáticos, tais como a variabilidade inter-funcionamento, são removidos a partir dos dados. Os dados podem agora ser visualizados traçando a robusta Z-escore médio das réplicas para cada poço (Figuras 2c e c '). As métricas de qualidade Heatmap A fim de visualizar os efeitos da chapa relacionado, graficamente os dados para cada placa como um mapa de calor por exemplo, usando a função heatmap.2 do pacote gplot 21. Desta forma, os efeitos de borda ou composto transição pode ser facilmente detectada (por exemplo, comparar com a figura 3a, com 3-B). Excluir placas sub-ótimas de uma análise mais aprofundada. Curva ROC Para determinar a sensibilidade ea especificidade do ensaio, calcular um receiver operating characteristic (ROC), por exemplo, com a ajuda do pacote bioconductor ROC 22 usando os valores de Z-score determinados em 7,2 (Figura 3c). Subsequentemente, determinar o AUC da curve. Um valor de AUC próximo de 1 indica uma alta sensibilidade e especificidade do ensaio. Hit Identificação Para otimizar o valor de corte para a identificação de compostos ativos, determinar o Índice de Youden. Para cálculo do índice, subtraia a verdadeira taxa positiva estimada (TPR) da taxa de falsos positivos (FPR) da curva ROC para o aumento da Z-score valores de corte robustas. Leve o robusto Z-score com o maior Índice de Youden (TPR menos FPR) como o ponto de corte. O TPR / FPR pode ser estimada através da detecção de poços de controlo positivos ou de compostos activos conhecidos dentro da biblioteca. Ao usar o controle positivo poços certificar-se de que elas coincidam com a força sucesso antecipado. 8. O reteste Reavaliar compostos de golpes positivos larvas por tratamento com diluições em série dos compostos obtidos a partir de um fornecedor diferente, utilizando a mesma configuração de gravação descrito anteriormente. Sucessos verdadeiros devem induzir uma luminescêncialso neste ensaio, idealmente, de uma forma dependente da dose.

Representative Results

Em publicação anterior 18, nós analisamos uma biblioteca de 640 medicamentos aprovados pela FDA em uma tela de piloto para avaliar o desempenho do ensaio grizly. Esta biblioteca continha 12 bona fide GC, permitindo-nos determinar medidas de qualidade para a sensibilidade e especificidade do ensaio. A Figura 2 mostra exemplos típicos de análise de dados brutos e normalização tomadas a partir desta tela. Um resultado típico de um controlo de dexametasona também é descrito na figura 2a, que ilustra a informação temporal dado pelos dados. Um pico na bioluminescência que ocorre em cerca de 12 horas após o tratamento diminui lentamente ao longo de 36 horas a seguir de medição. Figura 2a 'realça a aproximação do valor AUC usando o método trapezoidal. Este cálculo é realizado para todas as cavidades e cada repetição técnica. O resultado da transformação logarítmica está mostrado nas Figuras 2b </Strong> e b '. Aqui, a média dos controlos positivos são representados num gráfico QQ normal. Log transformação conduz a uma maior aproximação dos pontos de dados para os valores normalmente distribuídos teóricas indicadas pelas diagonais vermelhas. Uma transformação para alcançar a normalidade dos dados aumenta o poder estatístico das análises subsequentes. Finalmente, Figuras 2c e 2c 'mostrar o efeito da forte normalização Z-score na variabilidade placa-a-placa: Os diferentes valores iniciais obtidos com placas diferentes (Figura 2C) são normalizados no lote Z-score robusto na Figura 2c. Os valores de Z-robustas pontuação pode ser usado para identificar os erros sistemáticos dos dados através da visualização da distribuição dos acessos através das placas. Figura 3a mostra um exemplo de um mapa de calor de uma biblioteca de placa, no qual o sólido de pontuação Z values são plotados um código de cores para as posições também. Uma identifica facilmente coluna 12 com os controlos positivos em placa. Compostos da biblioteca de pontuação positivos são vistas em bem F8 e, embora mais fraca, E2. Figura 3b mostra uma placa, na qual um erro sistemático está presente. Observa-se uma série de compostos com valores decrescentes Z-score em linhas A e E ao longo de várias colunas. Nenhum dos compostos nestes poços foi testado positivo no novo ensaio. Uma vez que os poços com esta diminuindo a atividade de teste grizly são colocados ao longo do trajeto do robô de pipetagem toma quando alíquotas das placas da biblioteca, este padrão é indicativo de carry-over de um composto positivo durante o processo de pipetagem automatizada. O robusto normalização Z-score, juntamente com a presença de GCs conhecidos na biblioteca também nos permitiu calcular um receiver operating characteristic (ROC) para a tela 18. Figura 3c mostra um gráfico da estiacasalado verdadeira taxa positiva contra a taxa de falsos positivos estimados para diferentes Z-score valores de corte robustas. A taxa positiva verdadeira estimativa é definida como a percentagem de resultados positivos verdadeiros (aqui, os glucocorticóides conhecidos presentes na biblioteca) que se encontram a uma dada Z-pontuação valor de cut-off robusta. A estimativa taxa de falsos positivos correspondente indica a percentagem de compostos não-positivas bater neste valor de corte. A AUC da curva é de 0,95, indicando uma elevada sensibilidade e especificidade da tela e excelente desempenho do ensaio. A curva AUC também foi usado para estimar o valor de corte ideal para a identificação de sucesso por meio do cálculo do índice de Youden para diferentes escores Z robustos. Identificamos o robusto Z-score de 1,49 como tendo o maior índice de Youden. Este valor de corte é indicado na Figura 2c 'como uma linha preta separando os acessos de a maior parte dos compostos. Em nossa tela18, fomos capazes de identificar GCs quase todos conhecidos presentes na biblioteca. Apenas três dos 12 GCs bona fide não foram detectados. No caso do acetato de melengestrol, este foi um resultado falso negativo, uma vez que este composto testado positivo no novo ensaio em uma concentração mais elevada do que a utilizada na biblioteca. Os outros dois GCs foram negativos também na re-teste. Corticosterona é o principal GC em roedores, mas não em seres humanos ou de peixe 1, enquanto que a pró-droga prednisona não pode ser metabolizado bem pelo sistema de larvas. Interessantemente, também duas drogas não anotados como GCs foram identificados no ecrã, um dos quais não pode ser confirmada no re-teste (espironolactona, um antagonista do receptor de mineralocorticóide). O outro composto, pregnenolona, é um precursor na biossíntese de esteróides, que é convertido para o cortisol pelas glândulas supra-renais. De facto, o tratamento com pregnenolona estimulou a produção de cortisol no larvas 18. Todos estes resultados confirmam a alta performance do ensaio: apenas um falso negativo e um composto de falsos positivos estavam entre os resultados da tela principal, e 10 dos 11 compostos confirmadas com a sinalização GC atividade estimulante já foram identificados na tela principal. Figura 1. Princípio geral do ensaio e fluxo de trabalho do processo de seleção. A) Esquema da grizly ensaio repórter construto. Luciferase (amarelo) a expressão é controlada por um promotor mínimo (P min, laranja) e quatro elementos de GRE concatemerized ((GRE) 4, branco), que estão ligados por activados por ligandos homodímeros GR (GR, azul). Caixas vermelhas indicam sítios de transposase Tol2 que facilitam a integração da construção no genoma. A caixa-de-rosa representa um sítio de poliadenilação (PA). Larvas transgénicos portadores deste construct são colocados em placas opacas de 96 poços de microtitulação para medições de bioluminescência. b) Esquema da reacção da luciferase. A luciferase catalisa a oxidação de luciferina para oxiluciferina, o que conduz a emissão de luz (hv). A reacção requer também ATP e Mg 2 +, que é fornecido pela larva. PP i, pirofosfato. C) Fluxo de trabalho da tela. Trabalhando diluições de reserva são preparadas a partir de uma biblioteca de fármacos aprovados pela FDA, em placas de 96 poços, uma coluna contendo uma negativa dentro da placa de controlo (só DMSO, verde) e uma coluna que contém um controlo positivo (dexametasona, vermelho) (design da biblioteca). GRE: larvas Luc são distribuídas em placas de 96 poços (5-11 réplicas) e tratada com os compostos da biblioteca (aplicação da droga). Bioluminescência traços são gravados com um leitor de bioluminescência para dois dias (coleta de dados). Bioluminescência traços são integrados (cálculos da AUC), ingresse transformada e robusto Z-score normalizado (normalidadezação). Dados normalizados são utilizados para a determinação de métricas de qualidade e para a identificação de acerto (análise de dados). Sucessos escolhidos são testados novamente para a atividade dose-dependente no ensaio (reteste). Clique aqui para ver maior figura . Figura 2. A análise dos dados ilustrado com dados de uma tela de uma biblioteca de fármacos aprovados pela FDA. a) rastreio representativas a partir de um controle positivo. uma ') A área sob a curva (AUC) é aproximada com a regra de trapézio. Os trapézios utilizados para o cálculo são apresentados em diferentes tons de vermelho. B) Normal QQ plot dos valores de matérias-AUC dos poços de controlo positivo (eixo y) contra um (eixo x-padrão normal da população) antes de transformação log. B ' ) Normal QQ plot dos valores da AUC após transformação log. Uma distribuição normal é indicado pela linearidade dos pontos de dados de log transformado. C) Lote de log transformado dados brutos para todos os compostos testados na tela. Azul, bona fide glicocorticóides;. Cinza, todos os outros compostos c ') Lote de dados da tela após robusto normalização Z-score. Os erros sistemáticos, tais como as variações inter-chapa foram removidos a partir dos dados. As linhas vermelhas indicam a média ± SEM de controles positivos dentro da placa. Preto linha: bater identificação valor de corte, conforme determinado pela otimização Youden-Index (Figura 3). Reproduzido com permissão de 14 de 2012 ACS. Clique aqui para ver maior figura . 0439fig3.jpg "/> Figura 3. Resultados tela. a) Zona de acção de resultados na tela. Valores Z-score robusto de compostos de biblioteca são plotados nas respectivas posições bem. Os controles positivos na coluna 12, bem como dois compostos de golpes positivos em poços F8 e E2 são visíveis. B) Mapa de calor de uma placa com carry-over de um composto positivo durante a preparação da biblioteca com um robô de pipetagem. Um gradiente de atividade é visível ao longo do trajeto de pipetagem feita pelo robô. C) Receptor característica ROC) (em operação para a tela. As verdadeiras taxas estimadas positivas (eixo y-esquerdo) e taxas de falsos positivos (eixo-x) são plotadas para o aumento da Z-score valores de corte robustas (codificados por cores, eixo y da direita). O valor AUC da curva resultante é próximo de 1, indicando bom desempenho do ensaio. Compostos Reproduzido com permissão de 14 de 2012 ACS. D) O quadro mostra ativa (Yellow) ou inativa (azul) no ecrã principal (prim.) ou no reteste. glicocorticóides Bona fide nem sempre foram novamente testados (branco). Redesenhado com permissão de 14 de 2012 ACS. Clique aqui para ver maior figura . Definições gerais: Passo 1.1 Procedimento Tipo: líquido único modo: soprar dispensa por aspirado: 1 otimizar a velocidade: Sim sistema de aberturas de ar: 10 ul transporte: 0 Lave / Wash Não Aspirado Tipo de definição Valor observações Posição B7, B10, B13, B16 Aspirar Vol. 10 ul Velocidade 200 ul / seg Rastreamento líquido 60% Aspirar Altura Padrão Labware 22.28 Dispensar Tipo de definição Valor observações Posições D7, D10, D13, D16 Dispensar vol. 10 ul Velocidade 200 ul / seg Rastreamento líquido 100 ul Dispensar Altura Padrão Labware 17.01 Passo 1.2 Procedimento Tipo: reagente modo: desperdício dispensa por aspirado: 3 otimizar a velocidade: Sim sistema de aberturas de ar: <td colspan= "2"> 15 mL transporte: 0 Lave / Wash Não Aspirado Tipo de definição Valor observações Posição A4 Aspirar Vol. 3 x 490 ul Lacunas de ar 15 e 0 Velocidade 200 ul / seg Rastreamento líquido 400% Aspirar Altura Superfície líquida Dispensar Tipo de s etting Valor observações Posição D7, D10, D13, D16 Dispensar vol. 490 mL Lacunas de ar 15 e 0 Velocidade 200 ul / seg Rastreamento líquido 100% Dispensar Altura Padrão Labware 17.01 Tabela 1. Configurações para Multiprobe II. O protocolo na Tabela 1 descreve a preparação de 4 placas (cada 96 poços). As placas encontram-se em placas de chapa na zona de trabalho, em posições especificadas pelo robô (por exemplo, B7, B10, B13, B16). 1 "fo: manter-together.within-page =" always "> Definições gerais: Número de repetições do ensaio dependente do comprimento da corrida Número de placas ilimitado O controle de temperatura 28 ° C Protocolo Cálculos EUA Lum 96 (cps) ler Tempo de medição 2,5 seg Correção Crosstalk Distância entre a placa eo detector 0 milímetros Brilho (CT2) fator de correção 0% conteúdo "> Tabela 2. configurações Envision utilizados para a tela.

Discussion

Apresentamos aqui o fluxo de trabalho e análise de dados para uma tela química medir a atividade GC in vivo utilizando o ensaio grizly ^18. O ensaio tem características de controle de qualidade e medidas de desempenho que são comparáveis com telas de celulares baseados convencionais, uma importante vantagem para o seu uso em ambientes de alto rendimento. Além disso, no entanto, o ensaio in vivo em detecta também compostos que não são acessíveis para in vitro telas. Isto é exemplificado pela presença da pregnenolona prohormona entre as visitas. Assim, o ensaio grizly alarga o âmbito de telas destinadas a atividade de sinalização GC.

A importância da detecção de efeitos in vivo com o nosso ensaio também é ilustrado pelos resultados obtidos com o TCD poluentes organo-estanho e TBT ^18. DBT, mas não TBT, demonstrou inibir a sinalização do GC em cultura de células de mamíferos, e observou-se o mesmo em culturas de células de peixes-zebra expressarção do GRE: Luc repórter. Importante, no entanto, no ensaio grizly, TBT mostrou actividade inibidora na via de GC, como ele pode ser convertido para DBT pelo metabolismo das larvas. Esta inibição foi já observado em concentrações ambientalmente relevantes de TBT. Estes resultados ilustram ainda mais o potencial do ensaio grizly na detecção de efeitos de compostos com base em, inter-órgãos conversa cruzada e modificações metabólicas dos compostos em que o animal vivo. Eles também destacam o potencial de aplicação do ensaio grizly para o monitoramento ambiental. Assim, os efeitos do sistema endócrino disruptor pode ser estudada ao nível de sinalização do receptor, onde o disruptor interfere com a actividade de sinalização de GC induzida por um agonista de GR, tal como dexametasona. Outra possibilidade é o de estudar os efeitos do composto sobre a síntese de GC-estimulado pregnenolona. A elevada qualidade do rendimento do ensaio deve permitir a pesquisa rápida de bibliotecas de amostra ambiental.

A utilização de ar como a luciferaseeporter gene permite uma alta gama dinâmica de detecção de atividade ²³ sinalização. Com efeito, a sensibilidade do teste torna possível detectar a produção osmótica GC induzida por stress de larvas único ^18. A alta resolução temporal obtida com o repórter luciferase nos permite seguir as actividades de sinalização ao longo do tempo, o que faz com que seja possível analisar também a cinética dos dados.

Uma desvantagem potencial para algumas aplicações é a adequação limitada para monitoramento espacial desse sistema repórter. Sistemas repórter fluorescentes poderia ser mais adequada para os ensaios que exigem vigilância de determinadas áreas de larvas. No entanto, tais ensaios podem sofrer de sensibilidades mais baixas devido a efeitos de fundo causado pela luz de excitação, que também representa os limites de detecção de compostos fluorescentes. Além disso, eles podem proporcionar menos resolução cinética devido à geralmente maior estabilidade de proteínas fluorescentes ^23.Além disso, eles apresentam desafios em termos de equipamentos de imagem, análise de dados e armazenamento de dados que pode limitar seu uso para laboratórios de pesquisa menores.

O set-up do ensaio grizly como um ensaio de placa de microtitulação com base permite uma fácil integração em fluxos de trabalho de triagem típicas. O ensaio é facilmente aplicável também em laboratórios de pesquisa menores, devido ao seu fácil manuseio e análise de dados. Ao mesmo tempo, permite um elevado grau de automação, por exemplo, aplicação automatizada de drogas pipetando robôs ou distribuição automatizada de embriões por triagem de embriões dispositivos ^24,25. A leitura simples não necessita de microscópios de rastreamento automatizados ou software de análise de imagem sofisticado, mas fornece um rico conjunto de dados sobre os aspectos temporais e quantitativos da via de sinalização estudado.

Em resumo, apresentamos um protocolo passo-a-passo para um ensaio relativamente barato, robusto e fácil de manusear screening químico para GCactividade de sinalização in vivo e em tempo real. O ensaio permite a determinação de efeitos in vivo dos compostos sobre a GC sinalização não detectáveis em ensaios de cultura de células de base. Entre as muitas aplicações para o ensaio são por exemplo, a determinação de efeitos genéticos sobre a sinalização glicocorticóide, monitoramento ambiental dos efeitos desreguladores endócrinos sobre a síntese de glicocorticóides e atividade de sinalização, e ao rastreio de compostos para efeitos indesejados sobre a sinalização GC ou de romance em moduladores vivo desta importante via de sinalização.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos S. Burkhart, C. Hofmann e Simone Gräßle pela excelente assistência técnica e somos gratos a M. Ferg para obter ajuda com a análise de dados. Agradecemos também a S. Rastegar para comentários críticos sobre o manuscrito. Reconhecemos financiamento pelo Studienstiftung des deutschen Volkes (a MW), o DFG (DI913/4-1) e os Biointerfaces Programa de Helmholtz no KIT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
			Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH & Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂
			Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
			Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
			Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe

Referanslar

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Glucocorticoid Signaling Zebrafish Larva Luciferase Reporter System Chemical Screening GRIZLY Assay In Vivo High-throughput Screening Endocrine Disruptors Stress Research

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Weger, B. D., Weger, M., Jung, N., Lederer, C., Bräse, S., Dickmeis, T. A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System. J. Vis. Exp. (79), e50439, doi:10.3791/50439 (2013).