A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Benjamin D. Weger; Meltem Weger; Nicole Jung; Christin Lederer; Stefan Br&#228;se; Thomas Dickmeis

doi:10.3791/50439

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Biyoloji

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

Published: September 10, 2013

doi:

10.3791/50439

Benjamin D. Weger¹, Meltem Weger¹, Nicole Jung², Christin Lederer¹, Stefan Bräse^1,3, Thomas Dickmeis¹

¹Institute of Toxicology and Genetics,Karlsruhe Institute of Technology – Campus North, ²Institute of Organic Chemistry,Karlsruhe Institute of Technology – Campus North, ³Institute of Organic Chemistry,Karlsruhe Institute of Technology – Campus South

Özet

글루코 코르티코이드 응답 생체 Zebrafish의 루시 페라 제 활동 (GRIZLY) 분석 : 우리는 zebrafish의 애벌레를 사용하여 글루코 코르티코이드 스트레스 호르몬 신호에 대한 화학적 스크리닝 시스템의 절차와 데이터 분석에 대해 설명합니다. 분석은 민감하고 특히의 물질 대사가 필요하거나 내생 글루코 코르티코이드 생산에 영향을 미치는 화합물에 의한 글루코 코르티코이드 신호에 영향을 감지합니다.

Abstract

글루코 코르티코이드 스트레스 호르몬 및 그 유도체 인공 널리 염증을 치료하는 약물을 사용되지만, 글루코 코르티코이드 장기 치료는 심각한 부작용을 초래할 수있다. 테스트 시스템은 생체 내에서 글루코 코르티코이드 시그널링을 좌우하는 신규 화합물을 검색하거나 코르티코이드 신호 전달 경로의 화합물의 원치 않는 효과를 결정하기 위하여 필요하다. 우리는 생체 내에서 실시간으로 글루코 코르티코이드 활동 신호를 측정 할 수있는 형질 전환 제브라 피쉬 분석을 설립, GRIZLY 분석 (글루코 코르티코이드 생체 Zebrafish의 루시 페라 제 활동에 응답). 루시 페라 기반 분석은의 물질 대사가 필요하거나 내생 글루코 코르티코이드 생산에 영향을 미치는 화합물에 의한 효과를 포함 민감도와 특이도가 높은과 글루코 코르티코이드 신호에 영향을 감지합니다. 우리는 여기에서이 분석과 화학 화면을 수행하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 데이터 수집, 정규화 및 설명분석, 품질 제어 및 데이터 가시화에 초점을 배치. 분석은 간단하고, 시간 분해, 정량적 판독을 제공합니다. 그것은 독립 실행 형 플랫폼으로 운영 할 수있다, 또한 쉽게 높은 처리량 검사 워크 플로우에 통합되어 있습니다. 그것은 또한 같은 호르몬이나 스트레스 연구의 환경 모니터링과 같은 화학적 스크리닝 이후 많은 응용 프로그램 수 있습니다.

Introduction

글루코 코르티코이드 GCS (는) 스트레스 반응 동안 및 ^하나의 대사 조절에 중요한 역할을 부신 의해 생성 스테로이드 호르몬이다. GC를이 바인딩에, 핵 ^2로 이동시키다 핵 수용체 슈퍼 패밀리의 세포질 글루코 코르티코이드 수용체 (GRS)를 결합한다. 여기에, 그들은 예를 들어 다른 전사 인자 (transrepression)을 방해하여 전사를 억제 또는 글루코 코르티코이드 반응 요소 (그레, 전이 활성화)을 통해 유전자의 전사를 활성화 할 수 있습니다. 으로 인해 항 염증으로, 자연과 인공 모두 GC를 널리 천식이나 관절염 ^3과 같은 질병의 숫자의 치료에 약물을 사용합니다. 그러나, GC에 특히 장기간 사용은 당뇨병과 녹내장 ⁴ 등의 심각한 부작용을 초래할 수 있습니다. 따라서, 잠재적으로 더 유리한 처리 효율 및 내약성 시그널링 GC 타겟팅 신규 화합물은 적극 후방을 구 아르어. 중요한 것은, 배양 된 세포에서 관찰 리간드 효과는 생체 내 ^5에서 볼과 다를 수 있습니다. 이러한 효과는 기존의 세포 배양으로 얻은 편견의 결과는 의약품 심사 분석을 기반으로 할 수 있습니다. 이 세포 배양 ^6,7에서 불검출 효과의 결정을 허용하는 제브라 피쉬 모델에 의해 활성화로 화학 생체 검사는 최근의 초점이되었다.

호르몬 신호 전달 경로는 또한 환경 오염 물질에 의해 영향을받을 수있다. 소위 내분비 교란 화학 물질 (내분비 계 장애 물질)은 다양한 호르몬 조절 과정 ^{8에 영향을} 미칩니다. 따라서, 재생 및 수생 생물의 성적 분화는 에스트로겐 등의 활동을 물질에 의해 조절 될 수있다. 최근 우려는 신진 대사 장애는 환경 ⁹ 내분비 계 장애 물질에 링크 될 수 있다고 제기되고있다. 예 : "신진 대사 장애"의 대상이 하나의 경로는 이종에 연루되어 글루코 코르티코이드 경로입니다개발 및 면역 기능 ^{10, 11에} 바이오 틱 효과. 그러나 성 스테로이드 호르몬의 작용을 방해하는 화합물에 대한 정보 제공의 많은 양에 비해 상대적으로 적은는 GR를 통해 매개 내분비 장애 효과에 대해 잘 알려져 있습니다. 따라서 도구는 생체 내에서 GC 신호에 오염 물질의 효과를 모니터링을 허용하는 필요합니다.

제브라 피쉬는 긴 발달 생물학의 인기 모델 왔으며 최근에는 또한 내분비학 ⁽¹²⁾ 등 다른 분야의 연구자를 모으고있다. 많은 다른 물고기 종 ^13-15에서 중복 수용체에 반대 제브라 게놈 하나만 GR 유전자를 포함하기 때문에, 다른 teleosts와 비교해, 제브라 피쉬의 GC 시그널링 시스템은 포유 동물의 것과 더 유사하다. 또한, 시상 하부 – 뇌하수체 – 부신 축이 스트레스에 대한 응답으로 내생 GC의 생산을 증가하는 5 일 된 제브라 피쉬의 유충에 이미있는 기능입니다 ^14,16-18.

루크, 생체 내에서 실시간 ¹⁸ GC 신호 활동을 모니터링 할 수 있습니다 : 우리는 최근 형질 전환 제브라 피쉬 라인, GRE를 생성 한. 라인은 최소한의 TATA 상자 프로모터와 네 concatemerized 그레 (그림 1a)의 제어하에 루시퍼 라제 리포터 유전자 구조를 전달합니다. GC에 의한 생물 발광은 하나의 GRE에서 측정 할 수있다 : 시간의 연장 기간 동안 생체 내에서 96 웰 마이크로 플레이트에 루크 애벌레. ( "글루코 코르티코이드 응답 생체 Zebrafish의 루시 페라 제 활동"에 대한)이 GRIZLY 분석은 스트레스 연구, 환경 모니터링 및 약물 스크린 ¹⁸ 등 다양한 연구 분야의 숫자에서 사용할 수 있습니다. 우리는 단 하나의 유충에서 삼투 스트레스 후 코르티솔의 내생 적 상승을 감지 할 수 있었고, 개발하는 동안 응답의 성숙을 수행 할 수 있습니다. 또한, 우리는 유기 주석의 GC 신호에 미치는 영향을 모니터링 할 수유충으로의 물질 대사를 필요로의. 중요한 사실은, 라인은 환경 관련 농도에서 이러한 효과를 검출 할 수 있었다. 마지막으로, 파일럿 화면 상 분석은 민감하고 특이 유충에서 내인성 코르티솔의 생산을 자극 한 화합물을 포함하여, 화학적 라이브러리에서 GC 활성을 갖는 화합물을 발견. 여기에서, 우리는 GRIZLY 분석을 사용하여 화학 화면에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Protocol

1. 준비 화학 라이브러리의 작업 희석 테스트 할 약물 라이브러리의 화합물을 예비 희석 로봇 액체 처리 스테이션 (예 Multiprobe II, 8 바늘과 E3 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘)에 (예를 들어, FDA는 약물, 엔조 생명 과학 승인) 처분 팁 어댑터, 퍼킨 엘머). 적당한 농도는 3 % DMSO의 예 40 μg / ㎖이다, 그러나 이것은 사용 된 라이브러리의 유형에 달려있을 것이다. 후술의 단계에 대응 Multiprobe II 설정은 다음 표 1에 나타내었다. 표에 기재된 프로토콜은 병렬 개의 분취 플레이트의 제조를 허용한다. 깊은 우물 플레이트 (예 : 96 – 잘 보관 플레이트, 둥근 음, 0.8 ㎖, ABgene)에 주식 라이브러리 (DMSO 2 ㎎ / ㎖)의 피펫 10 μL 씩 분주. 열 (1)과 (12)는 빈 상태로 두어야합니다 – 이러한 양극과 음극 내 플레이트 컨트롤을 받게됩니다. <l 난> Multiprobe II와 라이브러리의 준비 분주로 1 % DMSO와 E3의 490 μl를 분배. 희석 처리 팁없이 고정 된 바늘을 수행한다. 내 플레이트 컨트롤로 열 1과 열 12 (DMSO에서) 5 밀리미터 덱사메타손 용액 10 μL로 DMSO의 10 μl를 추가합니다. 모든 우물에서 DMSO의 농도는 긍정적 인 제어 우물에서 덱사메타손의 농도가 E3 / 3 % DMSO 100 μM입니다, 지금은 3 %입니다. DMSO 강한 접착 밀봉 시트와 플레이트를 밀봉. 사용 할 때까지 -80 ° C에서 접시를 저장합니다. 2. 리포터 물고기 사육 루크 유전자 변형 물고기 : GRE 사이의 그룹 교배의 자연 산란에서 배아를 수집합니다. 배아를 올려 28 ℃의 인큐베이터 4 일 포스트 수정 (DPF)까지 살균제 메틸렌 블루의 1 ㎎ / ㎖로 보충 E3 매체를 포함 9cm 페트리 접시에 넣는다 (60 이상) 정기적으로 E3 매체를 변경합니다. 루시 페라 중간 제목 "> 3. 준비 (E3L) 루시페린 분말을 함유하는 바이알에 dH보다 2 O를 첨가하여 50 mM의 수성 루시페린 스톡 용액을 준비한다. 이 원액은 몇 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. E3L 매체를 얻기 위해 0.5 ㎜의 최종 농도 E3 매체에 루시페린 스톡을 희석. 4. 96 웰 플레이트에 애벌레를 배포 팁의 약 5 mm의 차단 간략하게 날카로운 모서리 불타는 폭 넓은 내경 1 ㎖ 피펫 팁을 준비합니다. 조심스럽게 비이커에 페트리 접시에서 그들을 부어 여러 십자가 풀 애벌레. 부드럽게 체 (0.25 mm 직경의 기공 크기)에 그들을 쏟아져 즉시 E3L 매체로 채워진 작은 페트리 접시 (직경 5.5 cm)로 체를 배치하여 한 번에 수확이 약 50 애벌레. 넓은 구멍 피펫 팁으로, 흰색의 우물 한 유충을 각각 함유 배지 225 μl를 전송96 웰 플레이트 (OptiPlate, 퍼킨 엘머). 접착 밀봉 시트 (예 : TopSeal-A, 퍼킨 엘머)와 함께 판을 밀봉하고 밤새 28 ° C에서 그들을 품어. 이 예비 배양 즉시 루시페린, 배양 된 세포를 19도 발생하는 현상을 첨가 한 후, 생물 발광의 일시적인 변화의 기록을 방지 할 수 있습니다. 5. 약물 치료 -80 ° C 냉동고에 약 4 시간 사용 전에서 라이브러리의 작업 희석을 포함하는 플레이트를 제거합니다. 조심스럽게 접시 와동 간략 판의 맨 아래에있는 액체를 수집하기 위해 원심 분리기에 스핀. 애벌레 판에서 접착 밀봉 시트를 제거합니다. 수동 96 채널 피펫 장치 (예를 들어, 청산인, 스타인브레너)으로 위아래로 3 회 약 솔루션을 피펫. 그런 다음 위의 예와 유충을 (포함하는 우물에 화학 물질 라이브러리의 작업을 희석의 25 μL,이 나누어지는0.3 % DMSO와 E3 4 ㎍ / ㎖)의 최종 농도를 초래한다. 라이브러리 접시 당 유충으로 복제 플레이트 : 10 (최소 5)를 준비합니다. 접착 밀봉 시트와 플레이트를 밀봉하고 바코드 스티커와 각 판의 레이블. 6. 발광 기록 향상된 발광 감도 (퍼킨 엘머)와 상상의 생물 발광 리더의 적재 단위로 애벌레가 들어있는 접시를 넣어. 대안 적으로, 판독기와 조합하여 포유 동물 세포 배양 검사 시스템에 이용 된 것과 같은 로봇 화 배양기 시스템을 사용한다. 구상 리더는 표 2에 설명 된 것과 유사한 리더 설정을 사용하여 이틀 동안 기록 생물 발광. 요구되는 주행 시간과 일치하는 실행에서 플레이트의 개수에 분석의 반복 수를 적응시킨다. 실행의 종료 후, 샘플의 일반 독성을 평가하기 위해 죽은 애벌레의 존재에 대한 번호판을 확인ounds. 7. 데이터 분석 모든 데이터 분석은 커스텀 스크립트를 이용하여 통계적인 프로그래밍 환경 R에서 수행된다. AUC 계산 에 관계없이 자신의 운동 특성의 신호 GC를 활성화 화합물을 확인 심사 매개 변수로 기록 발광 흔적 (생물 발광 원시 카운트 대 시간)의 곡선 (AUC)에서 지역을 결정하기 위해. AUC는이 사다리꼴 규칙 ( '도 2a 및도 참조) 근사. 표준화 데이터의 높은 정상 상태 (도 2B 및 B ')를 보장하기 위해 AUC 값을 변환하는 로그. 다음 (20 참조) 강력한 Z-점수 방식에 각 라이브러리 판에 대한 로그 변환 AUC 값을 정상화. 이 정규화는 모든 데이터 요소의 중앙값으로부터 표준 편차의 개수를 나타내는 값을 초래한다. 이러한 방식으로,이러한 간 실행 변동성 등의 체계적인 오류, 데이터에서 제거됩니다. 이제 데이터가 각 웰 (그림 2C와 C ')의 복제본의 평균 강력한 Z-점수를 플롯에 의해 시각하실 수 있습니다. 품질 메트릭 히트 맵 gplot 패키지 (21)의 heatmap.2 기능 예를 사용하여 히트 맵으로, 각 판의 데이터를 플롯 플레이트 관련 효과를 시각화하기 위해. 이런 식으로, 가장자리 효과 또는 화합물 이월 간단하게 (예를 들면도 3b와도 3a와 비교)을 검출 할 수있다. 추가 분석에서 차선의 번호판을 제외합니다. ROC 곡선 분석의 민감도 및 특이도를 결정하기 위해, 7.2 (도 3c)에서 결정된 Z-점수의 값을 사용하여 ROC의 bioconductor 패키지 (22)의 도움으로 특성 (ROC) 곡선 등을 조작 수신기를 산출한다. 그 후,이 CU의 AUC를 결정RVE. 1에 가까운 AUC 값은 분석의 민감도와 특이도가 높은를 나타냅니다. 확인을 명중 활성 화합물의 식별을위한 컷오프 값을 최적화하기 위해, Youden 지수를 결정한다. 인덱스를 계산하려면, 강력한 Z-점수 한계 값을 증가 ROC 곡선의 위양성률 (FPR)에서 추정 된 사실 양성률 (TPR)을 뺍니다. 절단 점으로 가장 높은 Youden 지수 (TPR 마이너스 FPR)와 강력한 Z-점수를보십시오. TPR / FPR은 양성 대조군 웰의 또는 라이브러리 내의 공지 된 활성 화합물을 검출함으로써 추정 될 수있다. 긍정적 인 컨트롤을 사용하면 우물들이 예상 히트 강도를 일치하는지 확인합니다. 8. 재시험 셋업은 상술 한 바와 같은 기록을 이용하여, 다른 공급자로부터 얻어진 화합물의 일련의 희석으로 유충을 처리함으로써 포지티브 히트 화합물을 재평가. 진정한 히트 발광을 유도한다이상적으로는 용량 의존적으로,이 분석에 LSO.

Representative Results

이전의 간행물 (18)에서, 우리는 GRIZLY 분석의 성능을 평가하기 위해 파일럿 (640) 화면에 FDA 승인 된 약물의 라이브러리를 스크리닝. 이 라이브러리는 따라서 우리가 분석의 민감도와 특이도를위한 질 측정을 확인 할 수 있도록, 12 선의의 GC가 포함되어 있습니다. 그림 2는 원시 데이터를 분석하고이 화면에서 촬영 정상화의 전형적인 예를 보여줍니다. 덱사메타손 컨트롤의 일반적인 결과가 아니라 데이터에 의해 주어진 시간 정보를 보여주는 그림 2a에 도시되어있다. 치료 후 약 12 시간에서 발생 생물 발광의 피크는 천천히 사다리꼴 방법을 사용하여 AUC 값의. 그림 2a는 '측정의 36 시간을 강조 다음 근사 이상 감소한다. 이 계산은 모든 우물과 각 기술에 대해 반복 실시한다. 로그 변환의 결과는도 2B <에 도시/ strong> 및 B '. 다음은 양성 대조군의 평균은 정상 QQ 플롯에 그려지는. 로그 변환은 적색 대각선으로 표시된 정규 분포 이론 값 데이터 포인트의 큰 근사치에 이르게한다. 데이터의 정상을 달성하기 위해 변환은 후속 분석의 통계적 전력을 증가시킨다. 마지막으로,도 2C 및 2C는 '판 – 투 – 플레이트의 변화에 강력한 Z 점수 정상화의 효과를 보여 다른 플레이트 (그림 2C)로 취득 서로 다른 기준 값은 그림 2C의 강력한 Z 점수의 음모에 정규화'. 강력한 Z-스코어 값 플레이트에 걸쳐 히트의 분포를 가시화함으로써 데이터의 체계적인 에러를 식별하기 위해 사용될 수있다.도 3a를 라이브러리 플레이트의 히트 맵의 일례를 도시한다 강력한 Z-점수 브로단말은 물론 위치에 색으로 구분 꾸몄다. 하나는 쉽게에서 플레이트 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 열 (12)을 식별합니다. 긍정적 인 점수 라이브러리 화합물이 잘 F8에서 볼 수 있으며, 약한 불구하고 있으며, E2. 그림 3b는 체계적인 오류가 존재하는 한 접시를 보여줍니다. 하나는 여러 열에 대한 행과 E의 Z-점수 값을 감소와 화합물의 시리즈를 관찰합니다. 이 우물에있는 화합물의 어느 것도 재 테스트에서 양성 반응을하지 않았다. 이 감소 GRIZLY 테스트 활성 웰 라이브러리 플레이트를 분취 때 피펫 로봇 걸리는 경로를 따라 배치되어 있기 때문에,이 패턴은 자동 피펫 팅 과정 양성 화합물의 이월 나타낸다. 함께 도서관에 알려진 GC가의 존재와 강력한 Z-점수 정상화 또한 화면 (18)에 대한 특성 (ROC) 곡선을 작동하는 수신기를 산출 할 수있었습니다. 3C 그림 ESTI의 그래프를 보여줍니다다른 강력한 Z-점수 한계 값에 대한 예상 위양성률에 진정한 긍정적 인 속도를 결합. 추정 진정한 긍정적 인 환율을 주어진 강력한 Z-점수 컷오프 값에서 찾을 수 있습니다 (여기서, 라이브러리에 존재하는 알려진 글루코 코르티코이드) 참 긍정적 인 히트의 비율로 정의된다. 해당 추정 위양성률이 아닌 긍정적 인 화합물의 비율이 컷 – 오프 값에 타격을 나타냅니다. 이 곡선의 AUC는 화면과 뛰어난 분석 성능의 높은 감도 및 특이성을 나타내는, 0.95이다. AUC 곡선은 또한 다른 강력한 Z-점수에 대한 Youden 지수를 산출함으로써 히트 식별을위한 최적의 컷오프 값을 추정하는 데 사용 하였다. 우리는 가장 높은 Youden 인덱스를 갖는 것으로 1.49의 강력한 Z-점수를 확인했다. 이 컷 오프 값은 화합물의 대부분에서 안타를 분리하는 검은 선으로 그림 2C '으로 표시됩니다. 우리의 화면에서18, 우리는 도서관에 존재하는 거의 모든 알려진 GC를 식별 할 수 있었다. 만 12 선의의 GC를 세 가지가 검출되지 않았다. 이 화합물 라이브러리에 사용 된 것보다 더 높은 농도로 재 테스트에서 양성 반응 이후 melengestrol 아세테이트의 경우에, 이것은, 위음성 발견했다. 다른 두 GC가가 다시 테스트도 음성이었다. 전구 약물 프레드니손은 유충의 시스템에서 잘 대사되지 않을 수 있습니다 동안 코르티 코스 테론은 설치류의 주요 GC는 아니지만 생선이나 인간 1. 흥미롭게도 GC의 어노테이션이없는 두 약물은 하나가 다시 테스트 (스피로 노 락톤, 무기질 코르티코이드 수용체 길항제)에서 확인 할 수있는 화면에서 확인되었다. 다른 화합물, pregnenolone는 부신에서 코티솔로 변환 스테로이드 생합성의 전구체이다. 사실, pregnenolone 치료는 유충 18 코티솔 생산을 자극. 이러한 모든 결과는 높은 반환 한 확인분석의 ormance : 하나의 위음성 및 위양성 한 화합물이 기본 화면 결과들이었고, GC 신호 자극 활성을 가진 11 확인 화합물 (10)는 이미 기본 화면에서 확인되었다. 그림 1. 분석 및 심사 절차의 작업 흐름의 일반 원칙.) GRIZLY 분석 기자 구조의 계획. 루시 페라 제 (노란색) 표현은 최소한의 발기인 리간드 활성화 GR 동종이 량체에 구속된다 (P 최소, 오렌지)과 네 개의 concatemerized GRE 요소 ((GRE) 4, 화이트), (GR, 파랑)에 의해 제어된다. 빨간 상자는 게놈에 구조의 통합을 용이하게 Tol2의 트랜스 포사 사이트를 나타냅니다. 분홍색 상자는 폴리 adenylation 사이트 (PA)를 나타냅니다. 이 죄수를 운반하는 형질 전환 애벌레구조체는 생물 발광 측정을 위해 불투명 한 96 웰 마이크로 플레이트에 배치됩니다. b)는 루시퍼 라제 반응의 계획. 루시 페라 제는 발광 (hν)에 이르게, oxyluciferin에 루시페린의 산화를 촉진한다. 반응은 유충에 의해 제공되는 ATP와 마그네슘 2 +가 필요합니다. 화면의 PP의 난, 피로 인산. C) 워크 플로우. 작업 주식의 희석은에서 준비 FDA는 하나의 열 (만 DMSO, 녹색)과 양성 대조군 (덱사메타손, 레드) (라이브러리 디자인)를 포함하는 하나의 열 컨트롤의 플레이트 부정을 포함, 96 웰 플레이트에서 약 라이브러리를 승인했다. GRE : 루크 유충은 96 웰 플레이트에 분포 (5-11 복제) 및 라이브러리 화합물 (약물 응용 프로그램)으로 처리됩니다. 생물 발광의 흔적 이틀 (데이터 수집)에 대한 생물 발광 리더와 함께 기록됩니다. 생물 발광의 흔적이 (AUC 계산)이 통합되어, 로그 변환하고 강력한 Z-점수가 정상화 (normalization). 표준화 된 데이터 품질 메트릭을 결정하고 히트 식별 (데이터 분석)에 사용됩니다. 선택 안타가 분석 (재시험)에서 용량 의존적 활동을 위해 다시 테스트하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 2. 데이터 분석은 FDA가 약물 라이브러리 승인의 화면 데이터로 보여줍니다. )도 긍정적 인 제어 할 수 있습니다. ') 대표 추적은 곡선 (AUC)에서 지역은 사다리꼴 규칙과 근사. 계산에 사용되는 사다리꼴은 빨강의 다른 그늘에 표시됩니다. b)에 로그 변환하기 전에 긍정적 인 제어 우물 (y 축)의 원료 AUC 값 대 표준 일반 인구 (x 축)의 정상 QQ 플롯. B ' ) 일반 QQ 로그 변환 후 AUC 값의 플롯. 정규 분포는 로그 변환 된 데이터 요소의 선형성에 의해 지시된다. 로그 c) 플롯이 화면 전체에서 시험 화합물에 대한 원시 데이터를 변환. 블루, 선의의 글루코 코르티코이드;. 강력한 Z-점수 정상화 후 화면 데이터의 회색, 다른 화합물 C ') 플롯. 이러한 간 플레이트의 변화로 체계적인 오류는 데이터에서 제거되었습니다. 레드 라인은 긍정적 내 플레이트 컨트롤의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 블랙 라인 : Youden – 인덱스 최적화 (그림 3)에 의해 결정되는 식별 컷 – 오프 값을 기록했다. 14, 2012의 허가를 재현 ACS. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 0439fig3.jpg "/> 그림 3. 화면 결과. 스크린 결과) 히트 맵. 라이브러리 화합물의 강력한 Z-스코어 값은 각각의 우물 위치로 꾸몄다. 열 (12)의 양성 대조군뿐만 아니라 우물 F8과 E2에있는 두 개의 긍정적 인 히트 화합물 볼 수 있습니다. 피펫 로봇 라이브러리를 준비하는 동안 긍정적 인 화합물의 이월을 보여주는 판의 B) 히트 맵. 활동의 그라데이션이 로봇에 의해 촬영 피펫 팅 경로를 따라 볼 수 있습니다. C) 수신기 화면에 대한 특성 (ROC) 곡선을 운영. 예상 사실 양성률 (왼쪽 손 y 축)과 거짓 긍정적 인 속도 (X 축)은 강력한 Z-점수 한계 값 (색상 코드, 오른쪽 Y 축)을 증가시키기위한 꾸몄다. 결과 곡선의 AUC 값은 좋은 분석 성능을 나타내는 1 부근에 자리 잡고 있습니다. ,이 2012는 14의 허가를 재현 ACS. D) 표 나타내는 화합물을 활성 (여보 쇼기본 화면 (prim.) 또는 재시험에있는 W) 또는 비활성 (파란색). 선의의 글루코 코르티코이드는 항상 (흰색) 재시험되지 않았다. 14, 2012의 허가를 다시 그려 ACS. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 일반 설정 : 단계 1.1 순서 유형 : 하나의 액체 모드 : 불어 끄다 대기음 당 분배 : 1 속도 최적화 : 예 에어 갭 시스템 : 10 μL 교통 : 0 세척 / 워시 아니 대기음 설정의 종류 값 비고 위치 B7, B10, B13, B16 기음 권. 10 μL 속도 200 μL / 초 액체 추적 60 % 기음 높이 실험기구의 기본 22.28 분배 설정의 종류 값 비고 위치 D7, D10, D13, D16 권을 분배. 10 μL 속도 200 μL / 초 액체 추적 100 μL 높이를 분배 실험기구의 기본 17.01 단계 1.2 순서 유형 : 시약 모드 : 낭비 대기음 당 분배 : 3 속도 최적화 : 예 에어 갭 시스템 : <td colspan= "2"> 15 μL 교통 : 0 세척 / 워시 아니 대기음 설정의 종류 값 비고 위치 A4 기음 권. 3 × 490 μL 에어 갭 15와 0 속도 200 μL / 초 액체 추적 400 % 기음 높이 액체 표면 분배 의 유형 랩탑 설치 값 비고 위치 D7, D10, D13, D16 권을 분배. 490 μL 에어 갭 15와 0 속도 200 μL / 초 액체 추적 100 % 높이를 분배 실험기구의 기본 17.01 표 1. Multiprobe II의 설정. 표 1 프로토콜은 4 플레이트 (각 96 웰)의 제조를 설명한다. 플레이트는 로봇 (예 : B7, B10, B13, B16)에 의해 지정된 위치에서 작업 영역에 플레이트 어댑터에 있습니다. 1 "FO : 유지 – together.within 페이지를 ="항상 "> 일반 설정 : 분석 반복 수 실행의 길이에 따라 접시의 수 제한없는 온도 조절 28 ° C 프로토콜 계산 미국 안룸 96 (CPS) 읽기 측정 시간 2.5 초 크로스 토크 보정 플레이트와 검출기 사이의 거리 0mm (CT2) 보정 계수에게 놀 0 % 내용 "> 화면에 사용되는 표 2. 구상 설정.

Discussion

우리는 여기서 GRIZLY ^분석법을 사용하여 ^18에서 GC 생체 활성을 측정 화학적 화면 흐름 및 데이터 분석을 제시한다. 분석은 품질 관리의 특성과, 높은 처리량 설정에서의 사용을위한 중요한 장점 기존의 셀 기반의 화면과 대등 성과 측정이있다. 또한, 그러나, 생체 내 분석은 또한 시험 관내 스크린에 액세스되지 않는 화합물을 검출한다. 이는 히트 사이 프로 호르몬의 pregnenolone의 존재에 의해 예시된다. 따라서, GRIZLY 분석은 GC 시그널링 활동 목표 화면의 범위를 확장한다.

우리의 분석과 생체 내 효과의 검출의 중요성은 또한 우리가 유기 주석 오염 물질 DBT 및 TBT ^(18)로 얻어진 결과에 의해 도시된다. DBT,하지만 TBT는 포유 동물 세포 배양에서 GC 신호를 억제하기 위해 표시되었습니다, 우리는 표현 제브라 피쉬의 세포 배양에서 같은 관측GRE를 보내고 : 루크 기자. 이 유충 대사 DBT에 의해 변환 될 수있는 중요한 그러나 GRIZLY 검정법에서 TBT는 GC 통로에서 저해 활성을 나타내었다. 이 억제는 TBT의 환경 관련 농도에서 이미 관찰되었다. 이러한 결과는 더 살아있는 동물의 화합물의 간 장기 누화 및 대사 변형에 계 화합물의 효과를 검출하기에 GRIZLY 분석의 가능성을 예시한다. 또한 환경 모니터링을위한 GRIZLY 분석의 응용 가능성을 강조. 따라서, 환경 호르몬의 효과는 장애 물질이 덱사메타손과 같은 GR 작용 물질에 의해 유도 된 GC 신호 활동을 방해하는 수용체 신호의 수준에서 공부하실 수 있습니다. 또 다른 가능성은 pregnenolone 자극 GC 합성에 화합물의 효과를 연구하는 것입니다. 분석의 높은 처리량 품질 환경 샘플 라이브러리의 신속한 선별을 허용한다.

AR로서 루시퍼 라제의 사용eporter 유전자 활성 ^{(23) 신호의} 검출의 높은 동적 범위를 허용한다. 실제로, 분석의 감도는 가능한 한 유충 ^{(18)로부터} 삼투 스트레스 – 유도 GC 생산을 검출 할 수있다. 루시 페라 제 기자 달성 높은 시간 해상도는 우리가 그것을 가능 또한 데이터의 반응 속도를 분석 할 수 있습니다 시간에 신호 활동을 수행 할 수 있습니다.

일부 응용 프로그램에 대한 잠재적 인 단점은이 기자 시스템의 공간 모니터링에 대한 제한의 적합성이다. 형광 기자 시스템은 유충의 특정 영역의 모니터링을 필요로 분석에 더 적합 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 분석법 인해 또한 형광 화합물의 검출 한계치를 포즈 여기 광에 의해 발생 배경 효과 낮은 민감도 고통 수있다. 또한, 그들은 때문에 형광 단백질 ^(23)의 일반적으로 높은 안정성이 적은 운동 해상도를 제공 할 수 있습니다.게다가, 그들은 작은 연구소위한 그들의 사용을 제한 할 수 촬영 장비, 데이터 분석 및 데이터 저장의 관점에서 문제를 제시한다.

마이크로 플레이트 기반 분석과 GRIZLY 분석의 셋업은 일반적인 검사 워크 플로에 쉽게 통합 할 수 있습니다. 분석은 단순 처리 및 데이터 분석에 의한 작은 연구 실험실에서 쉽게 적용 할 수있다. 동시에, 그것은 예를 들어, 로봇을 피펫 또는 배아 선별 장치 ^{(24, 25)에} 의해 배아의 자동 분배하여 약 응용을 자동화 자동화 상당한 정도 허용한다. 간단한 판독 자동 검사 현미경 또는 정교한 이미지 분석 소프트웨어가 필요합니다, 아직 공부 신호 전달 경로의 시간적, 양적 측면에 대한 풍부한 데이터 세트를 제공하지 않습니다.

요약하면, 우리는 GC에 대한 상대적으로 저렴 강력하고 사용하기 쉬운 핸들 화학적 스크리닝 검사에 대한 단계별 프로토콜을 제시한다생체 내에서 실시간으로 신호 활동. 분석은 GC에 화합물의 생체 내 효과의 결정이 분석을 기반으로 세포 배양에서 검출되지 신호 수 있습니다. 분석에 대한 많은 응용 프로그램 사이에서 글루코 코르티코이드 신호, 스테로이드 합성 및 신호 활동에 환경 호르몬의 영향, 환경 모니터링, GC 신호 또는이 생체 변조기의 소설에 대한 원치 않는 효과에 대한 화합물의 심사에 대한 유전 적 영향의 결정 예이다 중요한 신호 전달 경로.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 우수한 기술 지원을 S. Burkhart의, C. 호프만과 시몬 Gräßle 감사 및 데이터 분석에 대한 도움말 M. Ferg에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원고에 중요한 코멘트 S. Rastegar 감사합니다. 우리는 Studienstiftung 데 deutschen Volkes 살 (MW로), DFG (DI913/4-1)와 KIT의 헬름홀츠 프로그램 BioInterfaces에 의한 자금 조달을 인정합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
			Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH & Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂
			Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
			Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
			Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe

Referanslar

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Glucocorticoid Signaling Zebrafish Larva Luciferase Reporter System Chemical Screening GRIZLY Assay In Vivo High-throughput Screening Endocrine Disruptors Stress Research

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Weger, B. D., Weger, M., Jung, N., Lederer, C., Bräse, S., Dickmeis, T. A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System. J. Vis. Exp. (79), e50439, doi:10.3791/50439 (2013).