对糖皮质激素信号A化学筛选程序与斑马鱼幼虫的荧光素酶报告系统

在以前的出版物18，我们筛选的640 FDA批准的药物库中筛试点评估GRIZLY检测的性能。这个库包含12 真正的GC，从而使我们能够确定的敏感性测定的特异性和质量的措施。 图2示出的原始数据的分析和归一化从该屏幕截取的典型例子。从塞米松控制的典型结果以及示于图2a中 ，示出了由数据提供的时间信息。这发生在治疗后约12小时的生物发光峰值缓慢下降超过使用梯形法的AUC值以下36小时测量。 图2a'突出了近似。这种计算是进行了全井和各技术重复。对数转换的结果示于图2b </STRONG> 和b'。在这里，阳性对照的平均值绘制在一个正常的QQ图。登录变换导致的数据点由红色对角线表示的理论正态分布值的较大近似。的变换，实现了数据的正常性增加了后续分析的统计力量。最后， 图2c和2c'显示的健壮Z分数归一化上的板到板变异性的影响：用不同的板（ 图2c）所得到的不同的基准值被归一化的鲁棒Z分数积在图2c'。 鲁棒Z分数值可用于通过可视化横跨板的撞击的分布，以确定在数据的系统误差， 图3a示出一个热图的库板，其中一个例子，其中强大的Z分数缬氨酸UE被标绘彩色编码到井的位置。一个容易识别柱12与中板阳性对照。阳性得分图书馆化合物被认为在井F8和，尽管弱，E2。 图3b示出的板，其中一个系统误差的存在。一个人观察了一系列化合物，有超过数列递减行A和E 的Z-score值。无化合物在这些井是在重新测试呈阳性反应。由于井用这种下降GRIZLY测试活动放在沿等分库板时，移液机器人经过的路径，这种模式是指示在自动移液过程中积极的化合物的结转。 的高强度Z-score规范化连同已知的选区在图书馆的存在也使我们能够计算受试者工作特征（ROC）曲线屏幕18。 图3c显示了估计值的积交配真阳性率对估计假阳性率不同的高强度Z分数的临界值。估计真阳性率被定义为真阳性的命中被发现在一给定的鲁棒Z分数的截止值，该值的百分比（在此，存在于库中的已知糖皮质激素）。相应的估计的假阳性率表示非正化合物的百分比击中在此截止值。这条曲线的AUC是0.95，这表明具有高灵敏度的屏幕和优良性能测定和特异性。的AUC曲线也被用来通过计算约登指数为不同的强大的Z值来估计命中识别的最佳临界值。我们确定了稳健的Z值的1.49为具有最高约登指数。此临界值是表示在图2c'作为黑线从大的化合物的分离命中。 在我们的屏幕18，我们能够确定存在于库中几乎所有已知的选区。只有未检出三12 善意的GC。中的醋酸美仑孕酮的情况下，这是一个假阴性结果，由于这种化合物测试在重试阳性在更高的浓度比在库中使用的1。另两个GC为阴性更有重新测试。皮质甾酮是在啮齿类动物的主要GC，但不是在鱼或人1，而该前药强的松可能不会通过幼虫系统代谢良好。有趣的是，还两种药物没有注释为选区分别在屏幕标识，其中一个不能在重试（安体舒通，盐皮质激素受体拮抗剂）证实。其它化合物，孕烯醇酮，是在类固醇的生物合成，这是由肾上腺转化为皮质醇前体。事实上，随着孕烯醇酮治疗刺激皮质醇生产幼虫18。所有这些结果证实了高表现ormance测定的：只有一个假阴性和一个假阳性的化合物是主要的屏幕结果之间，和10的GC信号刺激活性的11证实化合物已经确定在主屏幕上。 图1的分析和筛选程序的工作流程的一般原则。一）GRIZLY分析报道构建计划。荧光素（黄色）的表达是由一个最小启动子（P 分 ，橙）和4 concatemerized GRE元件（（GRE）4，白色），这是由配体激活的GR结合的同二聚体（GR，蓝色）进行控制。红色框表示TOL2转座的网站，便于整合构建成基因组中。粉红色的方块代表一个聚腺苷酸化位点（PA）。转基因幼虫携带这con结构体被放置在不透明的96孔微量滴定板中进行生物发光测量。 二）萤光素酶反应的方案。萤光素酶催化荧光素向氧化萤光素，从而导致发光（hν）的氧化。反应需要也ATP和Mg 2 +的，这是由幼虫提供。 我的PP，焦磷酸。 三）工作流程的画面。工作原液稀释从制备的FDA批准的药物库在96孔板中，一列载板内的阴性对照（仅DMSO，绿色）和含有阳性对照组（地塞米松，红色）（库设计）一列。 GRE：吕克幼虫分布在96孔板（5-11复制），并与库化合物（新药申请）处理。生物发光的痕迹都记录了生物发光读者两天（数据收集）。生物发光的痕迹都集成（AUC计算），对数转换和强大的Z-得分归一化（的归限）。归一化的数据被用于确定质量度量和对于命中识别（数据分析）。选择命中都在试验（复试）重新测试剂量依赖性活性。 点击这里查看大图 。 图2。从一个FDA批准的药物库中的屏幕数据的数据分析说明。 a）由阳性对照孔。 一'）代表跟踪曲线（AUC）下的面积是近似梯形法则。用于计算梯形显示在不同深浅的红色二）正态QQ图的阳性对照孔（y轴）的日志转换前的原始AUC值与标准正常人群（x轴）的。B'。 ）正态QQ图对数变换后的AUC值的。一个正常的分布是通过对数转换数据点的线性表示。日志三）情节转换原始数据在屏幕上进行测试的所有化合物。蓝，糖皮质激素善意 ;强大的Z-score规范化后的画面数据的灰色，所有其他化合物C'）剧情。系统误差，例如板间的变化已经从数据中删除。红色线表示的正极板内对照的平均值±SEM。黑线：命中识别临界值由约登指数优化（ 图3）来确定。转载自14日批准的ACS。 点击这里查看大图 。 0439fig3.jpg“/> 图3。屏幕效果。 A）热图画面效果。化合物库的强大的Z评分值绘制成相应的孔位置。在塔12中的阳性对照，以及在井F8和E2 2阳性的命中化合物是可见的。一个板显示文库制备用移液机器人在正化合物的结转二）热图。活动的渐变是沿可见采取的机器人移液路径。 三）受试者工作特征（ROC）曲线屏幕。估计真阳性率（左手y-轴）和假阳性率（x轴）作图增加强大的Z值的临界值（颜色编码，右侧y轴）。所得曲线的AUC值接近1，表明良好的检测性能。转载许可14，2012 ACS。 四）表的示化合物活性（YELLOW）或无效（蓝色）在主屏幕（prim.）或复试。 善意糖皮质激素并不总是复检（白色）。重绘从14日批准的ACS。 点击这里查看大图 。 常规设置： 步骤1.1 程序 类型： 单液模式： 井喷省却每次抽吸： 1 优化速度： 是的气隙系统： 10微升交通： 0 冲洗/清洗 无 吸气 设置类型 值 备注 位置 B7，B10，B13，B16 吸卷。 10微升速度 200微升/秒液体追踪 60％ 吸液高度实验设备默认 22.28 豁免 设置类型 值 备注 职位 D7，D10，D13，D16 免除卷。 10微升速度 200微升/秒液体追踪 100微升点胶高度实验设备默认 17.01 步骤1.2 程序 类型： 试剂 模式： 浪费省却每次抽吸： 3 优化速度： 是的气隙系统： <td colspan="“2”"> 15微升交通： 0 冲洗/清洗 无 吸气 设置类型 值 备注 位置 A4 吸卷。 3×490微升气隙 15和0 速度 200微升/秒液体追踪 400％ 吸液高度液体表面 豁免 的S型廷 值 备注 位置 D7，D10，D13，D16 免除卷。 490微升气隙 15和0 速度 200微升/秒液体追踪 100％ 点胶高度实验设备默认 17.01 表1中。设置多探头二。表1中的协议描述了4片（每96孔）的制备方法。该板位于上板的适配器中的位置处由机器人（ 例如，B7，B10，B13，B16）中指定的工作区域。 1“FO：保持together.within页=”总是“> 常规设置： 实验重复次数 依赖于运行长度 板数无限温度控制 28°C 协议 计算 美国绥96（CPS）读 测量时间 2.5秒串扰校正板和检测器之间的距离 0毫米辉光（CT2）修正系数 0％ 内容“> 用于在屏幕表2中。的EnVision设置。