Manipulation génétique de la souris en développement à travers l'hypothalamus<em> In utero</em> Électroporation

La manipulation génétique du cerveau embryonnaire de souris est une approche privilégiée pour en apprendre davantage sur la régulation du développement. La génération de lignées de souris mutantes est cependant lent et coûteux. Une méthode puissante pour introduire des modifications génétiques spécifiques dans le développement des neurones du cerveau des mammifères est tr électroporation in utero. Essentiellement, la technique consiste à transfecter l'ADN dans le neuroépithélium cerveau embryonnaire au moyen d'impulsions électriques, puis permettre à l'embryon de survivre pendant un certain laps de temps, de recueillir le cerveau et les examiner une éventuelle roman, phénotypes informatives. De cette façon, l'expérimentateur peut tester des hypothèses presque immédiatement, sans les longues périodes d'attente nécessaires pour la production de mutants de souris.

Transfection d'ADN dans des embryons en développement a commencé par électroporation in ovo sur des embryons de poulet ^1. La preuve de concept essentiel pour la souris a été réalisée dans la culture <sup> 2. Ce fut bientôt suivi par les premières descriptions de la technique sur la souris in utero ^3,4.

Le principal problème consiste à transfecter le cerveau d'embryons en développement in utero sans eux ou la mère qui tue. Apprendre à effectuer la chirurgie nécessaire (laparotomie, l'injection, l'électroporation) nécessite une longue période de formation. Une fois que l'opération a été maîtrisé au point où le taux de survie des embryons est acceptable, la prochaine question clé est: quelles structures cérébrales sont-ils accessibles? Sans surprise, les premiers articles publiés montrant les résultats obtenus avec électroporation in utero axés sur le développement cortical ^5-9. Cela est encore vrai pour la plupart des publications utilisant cette technique, car la région du cerveau de souris en développement plus accessible à des procédures chirurgicales est le cortex (Figure 1). La procédure d'électroporation in utero dans le cortex a été décriten version imprimée et en vidéo ^{10 11-14.} Une modification de la technique peut être utilisée pour cibler une partie ventrale du télencéphale, les noyaux gris centraux ^15.

Au-delà du télencéphale, diencéphale (classiquement divisé en thalamus et de l'hypothalamus) est une région du cerveau antérieur plus difficiles à atteindre. Un petit nombre de documents ciblant des rapports de sa partie dorsale et le plus accessible, le thalamus ^16-19.

L'hypothalamus est la partie la plus ventrale du cerveau antérieur, donc celle localisée plus profondément de la surface dorsale (cortex) (Figure 1). Cette région reste un défi difficile pour les chercheurs engagés à manipuler génétiquement le cerveau de souris in utero. À notre connaissance, seuls quelques articles un rapport sur ​​les résultats de transfection in utero dans l'hypothalamus de souris ^20,21. Cependant, l'importance fonctionnelle de l'hypothalamus cannot être surestimée, car elle régule les comportements comme manger et de boire, l'accouplement, la reproduction et la parentalité ^22. En outre, les altérations dans le développement hypothalamique contribuent à provenir tard dans des conditions de vie comme l'obésité, l'hypertension, le diabète et la puberté précoce ^23. Être capable de modifier génétiquement l'hypothalamus au cours du développement constituerait un outil très puissant pour comprendre.

Le protocole chirurgical de base pour la laparotomie de souris gravides que nous utilisons ici est similaire à celle utilisée dans les autres protocoles ^11,13,14,24. Nous allons décrire ici brièvement par souci d'exhaustivité. La clé de notre procédure, d'autre part, sont le type d'anesthésie, l'endroit de l'injection, le type d'électrodes et de l'insertion et de la position de l'électrode positive par rapport à la tête de l'embryon. Nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par inhalation de gaz plus simples anesthésie intrapéritonéale, puisque le premier permet l'un peu plus longues périodes de narcose nécessaires pour une chirurgie difficile. Résultats d'inhalation isoflurane chez une récupération plus rapide de l'anesthésie, car, généralement, la mère démontre un comportement normal déjà minutes après la chirurgie. Le point d'injection de la solution d'ADN avec la micropipette de verre la plus simple est le ventricule latéral, ce qui est cependant tout à fait impropre à l'électroporation de l'hypothalamus. Injection directement dans le troisième ventricule est en effet crucial de cibler les structures diencéphaliques profondes. Il est possible de transfecter l'hypothalamus de E12.0 ou E12.5 à la norme électrodes, off-the-shelf. Nous avons trouvé quelques-uns des électrodes fabriquées par Nepa Gene (Chiba, Japon) particulièrement adapté à cet effet.

Grâce à notre procédure nous obtenons transfection de l'ensemble neuroépithélium hypothalamique ou transfection régionale partielle en fonction de l'orientation de l'électrode. Ici, nous démontrons la technique par transfection du corps mamillaire, sans doutele plus profond et le plus en retrait de tous les noyaux hypothalamiques. En outre, nous montrons l'analyse histologique détaillée des cellules transfectées jusqu'au niveau cellulaire de la résolution.

Une comparaison des électroporation in utero avec d'autres approches de la transfection le développement du cerveau de la souris in utero peut être trouvée dans la section Discussion.