Ayrıca yeni bir tanımlamak<em> In vivo</em> Görüntüleme tekniği bu kafa içi pencereler ve yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskopi ile çiftler floresan kimerik fareler. Bu görüntüleme platformu yardımcıları patolojik hakaret sonrasında bir tek hücre düzeyinde beyin dokusunda ve mikrovasküler dinamik değişiklikler, çalışmaları ve intrakranial ilaç dağıtım ve dağıtım değerlendirmek için uyarlanabilir.
Biz başarıyla entegre önce intrakranial doku yapısı değişiklikleri doğrudan uzun vadeli görselleştirme sağlayan yeni bir platform geliştirmek için intravital ile 2-foton konfokal mikroskopi Kafa içi pencere (ICW) teknolojisi 1-4 kurduk. Gerçek zamanlı şekilde tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme doku 'anlık görüntü' kesitlerde sadece bakar standart son nokta histolojik analiz, tarafından sağlanan ötesinde ek dinamik bilgi sağlar.
Floresan kimerik farelerde bu intravital görüntüleme tekniği kurulması, biz aynı anda görüntü dört floresan kanal edebiliyoruz. Bu GFP gibi + kemik iliği içeren floresan etiketli hücreleri tarafından, bu doku içinde uzun vadeli göç, entegrasyon ve farklılaşma okuyan bu hücrelerin kaderini izlemek mümkündür. Böyle bir MCherry glioma tümörünün hattı gibi bir ikincil raportör hücre, daha fazla entegrasyon karakterize sağlarhücre etkileşimleri: hücre dirilen. Doku mikro yapısal değişiklikler örneğin CD31 etiketli antikorlar ve Dekstran moleküller için, içi hayati boyalar ve antikor eklenmesi ile vurgulanmış olabilir.
Ayrıca, iyonize radyasyon uygulamasından sonra meydana gelen dinamik doku değişiklikleri değerlendirilebilir, üzerinden bir platform oluşturmak, stereotaktik radyoterapi sağlayan küçük bir hayvan mikro-ışınlama ile ICW görüntüleme modeli kombinasyonu tarif.
Bizim modeli Mevcut sınırlamaları beyin dorsal eksenine görüntüleme sınırlayan alt kortikal yüzeyinden 900 mm kadar bir derinliğe kadar sınırlıdır, mikroskop penetrans içerir. Kafatası kemik varlığı şu anda meme dokusu ve yağ yastıkları 5-7 incelemek için kullanılan daha kurulmuş ve kullanılan odasına modellere göre, ICW daha zorlu bir teknik işlemi yapar. Buna ek olarak, plaka ile ataides pek çok sorun görüntüleme optimize.
Çeşitli patolojilerin tepki olarak beyinde ortaya çıkan yapısal değişiklikler ve biyolojik ve terapötik müdahalelerin daha iyi anlaşılması, tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, özellikle kafa içi patolojiler ile ilgili, bu yapısal ve biyolojik değişiklikler eğitim mevcut zorluklardan biri, doku erişilememesi ve zamansal evrimi ve in vivo ortamda bir değişim dinamik ilerleme incelemek için yetersizliğidir. "Pencere" teknoloji üretimi daha önce 5-7 tümör gelişimi ile yumuşak doku değişiklikleri inceleyerek başarılı kanıtlamıştır. ICW modellerinin geliştirilmesi daha teknik zorlu, altta yatan beyin dokusunda enfeksiyon kışkırtmak üzerinde zarar vermeden kafatası kemiği kaldırmak için gerekliliği nedeniyle olduğunu kanıtlamaktadır. Önceki kağıtları yüksek çözünürlüklü net im üretmek için, ancak doku 8-10 görselleştirmek için kafatası inceltmek için çalıştılarkafatası kemik yaşları tam çıkarılması 11. gereklidir. Uzun süreli görüntüleme (30 gün +) ancak son zamanlarda görüntüleme 1,11 ile uygun bir seçenek haline gelmiştir tekrarlayın, daha önce kısa zaman dilimlerinde 5 incelenmiştir.
Son on yıl içinde önemli bir hedef tümörlerin tedavisi için yeni terapötik hedefler sağlamak için, tümör oluşumu ve ilerleme yanıt olarak, özellikle, neo-damar sistemi aşağıdaki patolojik uyaranların kökenli aydınlatmak için olmuştur. Çok tartışma tümör gelişimi ya da aşağıdaki radyasyon sırasında beyinde yeni damar kaynağı etrafında kalır. Geleneksel olarak vaskülarizasyon anjiyojenez, yeni damarlar önceden var olan gemiler 12 filizlenmesi ikinci oluşturan bir işlem boyunca ortaya olarak kabul edilmiştir. Daha yeni çalışmalar, ancak, vaskülogenez ve önceden tahmin embriyonik süreç patolojik damar oluşumu, daha önemli bir rol oynuyor olabilir düşündürmektedir. Vasculogenesis da daha sonra doğrudan yeni damar endotel 12-14 oluşumuna katılan kemik iliğinden yetişkin angioblast meslektaşları istihdamı içerir. Biriken deliller endotel öncü hücreler onkojenik aracılar 15-17 yanıt olarak de novo damar oluşumu başlatmak için kemik iliğinden seferber olduğunu gösterir. Ancak bu çalışmalar patolojik uyarıcı ve tedaviye 18-21 yanıt türüne değişen yüzde katkı ile damar endotel bu kemik iliğinden elde edilen hücrelerin doğrudan katkı (BMDCs) için çelişkili kanıt.
Bu nedenle, tümör damar içine ve tedaviye yanıt olarak BMDC entegrasyon sürecinin tekrar uzun süreli çalışma için yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme izin tekrarlanabilir deneysel yöntemler kurulması ölçülemez. Standart histolojik teknikler dinamik bulu sağlamak için başarısızformasyonu yeni damar oluşmasına neden olabilir ve bu yüzden kesin hücre etkileşiminin mekanizmaları göstermek olamaz hücrelerinin uzun süreli hayatta kalma, farklılaşma ve entegrasyon belirlemek için gereklidir.
Biz intrakranial iyonizan radyasyon ve tümör büyümesini hem de takip BMDC işe değişen derecelerde, ancak bir işe alım, patoloji özel konum ve değil tüm tümöral doku 11,22 bir işgal olduğunu bizim deneysel yaklaşım kullanarak göstermiştir. Biz işe tek bir hayvan 11,22 tekrar tekrar görüntüleme gösterdiği bir zaman duyarlı bir yol izler göstermiştir. Floresan etiketli tümör hücreleri doğrudan kendi endotel oluşturmak için tümör hücre transdiferansiasyon olasılığını vurgulamak için endotel hücreleri için içi hayati CD31 antikoru ile görüntülü ve takip edilebilir sayede Benzer şekilde, in vivo görüntüleme de tümör hücresi taklit içine değerli bilgiler sağlayabilir.
<pclass = "jove_content"> Modelin çok yönlülük hücresel ve biyolojik süreci değişen çalışma için kombinasyonları kapsamlı bir dizi sağlayan, görüntü 4 floresan kanal yeteneği ile geliştirilmiştir. Biz aynı anda zaman içinde tekrar tekrar tek bir alanda, intravitally görüntü CFP (mavi), GFP (yeşil), Kiraz / RFP (kırmızı) ve Alexa647/APC (uzak-kırmızı) edebiliyoruz. Araştırmacılar genetik olarak özel ilgi yapısal değişiklikleri vurgulamak için kanallarının yanı sıra satın alma boyalar ve antikorların her biri için fluorochromes ifade hücreleri değiştirebilirsiniz. Yaygın çalışmalarda kullanılan boyaların ve antikor Bugüne kadar CD31 ve dekstran dahil olan her iki vurgulamak Bu amaçla uzak-kırmızı kanalı kullanılmaktadır, ancak her ikisi de diğer kullanım için uygun olan mikro-damar ve doku 1,11,23,24 meydana gelen değişikliklerin, kanalları bahsetti. Benzer şekilde, Sytox apoptoz alanları vurgular Portakal, ve bu şirket Visen gelenler gibi işaretleri dahil olmak üzere diğer boyalar, SPE olmuşturcifically in vivo kullanım için tasarlanmıştır. Bahsedilen dört yaygın olarak kullanılan floresan kanalları, bundan başka, ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal eklenebilir ve damar çevreleyen bazal membran görselleştirme, görüntü modelinin 7 endojen kollajen lifleri için optimize edilmiştir.Bizim modelin uyum, hem de yukarıda bahsedilen hücre-hücre etkileşimleri göstermek için, ilaç-hücre etkileşimleri incelemek mümkün olmuştur. Biz AMD3100, bir SDF-1 inhibitörü ve BMDC işe 11 dahil ağları sinyal rolü gibi ilaç inhibitörleri baktım. Aynı şekilde biz genetik bir GFP molekülüne bir IRES ile birlikte VEGFTrap, bir VEGF inhibitörü 25, ifade etmek U87 glioma xenografts hücreleri tasarladık. TTT + BM kullanarak biz VEGF damar için BMDCs istihdamı üzerindeki rolünü çalışmak edebiliyoruz. En son biz mec bakarak ilaç kinetik çalışma modeli kullanmış olmasıBir hücresel düzeyde tümör sınırlarını belirleyen ilaç Floresein 26, arkasında hanism. Aracılığıyla bir özel inşa biz tedavi için tümör ve BMDCs hem de yanıtı değerlendirmek için stereotaktik teslim radyasyon entegre mümkün olmuştur evin küçük hayvan ışınlayıcı içinde.
Bizim yeni intravital görüntüleme yöntemi araştırmacıların kullanımı sayesinde doku değişiklikleri birçok fonksiyonel ve biyolojik özelliklerinin aydınlatılması yardım, çeşitli patolojiler ve sistemlerinde meydana gelen tek hücreli gerçek zamanlı değişiklikleri anlamak olacaktır.
Tüm görüntüleri açıklanan üç kanal şu ana kadar bir çok sayıda hücre tipleri ve etkileşimleri bakmak için araçlar paha biçilmez bir dizi diğer modelleri ve yaprakları araştırmacıların ilgi üç işaretleri için değiştirilebilir. Planlama bütün belirteçler ve hücre tipi başarılı bir şekilde ayrı kanal bir raportör molekülü floresan entegre etmiş sağlamak için gereklidir.
Burada kullanılan standart üç kanal ek olarak biz de dördüncü bir CFP kanal (Şekil 4A) ve SHG tabanlı kolajen kanal 7 (Şekil 4B) entegre başardık. Bu in vivo ve ek olarak hücresel etkileşimleri bakarak olasılığı uzanır sağlar Kullanıcı diğer belirteçler için iki kanal koruyarak belirli hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için karıştırma nüfus üstlenecek. Örneğin, kendi intratum karşılaştırarak bir ilgi ile 1:3 oranında tümör hücrelerinin (TTT) ve kanser kök hücreleri (OBP) baktımOral etkileşimleri (Şekil 4A). Biz karışık nüfusun 7 gün sonrası implantasyon oranı onadı ve her iki hücre popülasyonlarının hala görülebilir görülmektedir.
CFP kanal + hücreleri aslında GFP + olduğu olanlardan CFP doğru tanımlayan ve sonrası görüntü işleme gerektirir eksitasyon ve emisyon spektrumlarına hem de GFP gibi kanal ile örtüşme nedeniyle teknik sorunları içerir. Mesaj görüntüleme işleme Zeiss LSM yazılım doğrudan sayede inşa 2-foton mikroskop üzerinde yapılabilir, GFP görüntü (Şekil 4A) geride olan gerçek OBP hücrelerinde sonuçlanan OBP görüntü çıkarılır. Oranı çıkarma için öncül eşit parlak görüntüler bağlıdır ve GFP lazer (488 nm) iken OBP ve GFP hücreleri hem floresanlama CFP lazer (458 nm) nedeniyle OBP hücreleri floresan için çok yüksek. CFP ek olarak biz de SHG bakmak için daha önce yayınlanmış kurulumları kullanmak mümkün olmuşturdüzeyleri ve bu nedenle damar çevreleyen bazal membran, (Şekil 4B) oluşturan kolajen lifleri betimliyor.
Bu modelin bir diğer uyum çapı 2 mm kadar küçük doku bölümleri ışın tedavisi için stereotaktik rehberliğinde radyasyon kullanma yeteneğine sahip özel inşa küçük bir hayvan ışınlama avantaj aldı. Işımasıyla pencere hedefleyerek sahip temel dokusu üzerindeki etkisini radyasyon bakmak mümkündür. Biz son zamanlarda etkisi radyasyon bakarak bir çalışma yayınladı damar için BMDCs istihdamı ile ilgili olarak normal beyin dokusu üzerindeki sonrası radyasyon doku değişiklikleri rollerini de özellikle bakarak. Biz BMDCs istihdamı zaman ve normal doku 11'de bağımlı doz hem de oldu bulundu.
Bu ilacın sağlayan tedavi teslim ve entegrasyon mekanizmaları incelemek için mümkün olduğu bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş. Sırasındaaraştırma biz VEGFTrap üretimi, üretim 25 yerel alan tüm VEGF sinyal bloke bir anti-anjiyogenik ilaç izlemek mümkün olmuştur. VEGFtrap üretim, BMDC etkileşim ve aynı anda damar (Şekil 4Cii): genetik EGFP bir IRES ile birleştiğinde VEGFtrap gen (Şekil 4ci) ifade için tümör hücreleri değiştirerek ve TTT 'donör' BM kullanarak biz görüntü EGFP başardık. Bu modeli ve kanalları çok yönlülük gösterdi. Bu tek hücreli çözüm vaadi nedeniyle ilacın kinetik bakmak da mümkündür. Fluoresein (GFP +) maksimal rezeksiyon 26 sağlandığından emin olmak için cerrahi sırasında tümör tanımlamak için kullanılır. Intravenöz iken görüntüleme enjekte edilerek bu tarif tümör hücrelerinin kendilerini içine Floresein en aktif alımı yoluyla değil oluşur göstermek mümkündür, ancak bunun yerine ilacın koleksiyonu ile t stromal alanı içineFluorescein (Şekil 4D) ve enjeksiyonu takiben co-lokalizasyon 10 dakika eksikliği görülen ime,.
Genel olarak bizim strateji dinamik hücresel etkileşimlerin çalışmaya avantajlıdır benzersiz deneysel bir platform, elde etmek için yeni ve mevcut teknikleri birleştirir. Bu strateji intrakranial, tedaviye yanıt olarak BMDC, tümör ve normal beyin kanlanması yüksek çözünürlüklü tek hücreli dinamik evrim incelenmesi için çok değerli bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Intravital görüntüleme BMDC alımları, göç ve farklılaşma intrakranial beyin tümör damar hem de diğer araştırma alanlara adapte olabilen birçok başka dinamik süreçlerin moleküler düzenleyiciler daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Diğer tedavi stratejileri ile birlikte düzenlemeye BMDC inhibe olası faktörleri kombinatoryal tedavilerin hassas zamanlamasının belirlenmesi yardımcı olabilir. Ayrıca, bu strateji, birçok gelecek pr uyarlanabilirin vivo intravital boyama boyalar değil sadece kullanan değil, aynı zamanda küçük molekül inhibitörleri ve floresan araştırmacılar sıra kinetik de boyuna bakmak gibi daha hedefli tedavi dağılımı ve göç yollarını izlemek için izin etiketlenir nanopartiküller ojects.
The authors have nothing to disclose.
Biz 2Photon mikroskop kanallarının ilk kurulum kendi yardım için özellikle James Jonkman de, prenses Margaret hastanede Gelişmiş Optik Mikroskopi Tesisi teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Radyasyon Yanıt (STTARR) programı ve bağlı fon kuruluşlarının uzay-zamansal Hedefleme ve Amplifikasyon kabul etmek istiyorum. Biz VEGFTrap plazmid temin ve el yazması düzeltme ve geri bildirim için Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael ve Dr.Andras Nagy teşekkür ederim. BTRC de personel sürekli destek ve tartışma değerli olmuştur ve onun bilimsel girişi için Dr.Abhijit Guha anmak istiyorum. Çalışma CIHR ve NIH hibe tarafından finanse edildi.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |