新規高分解能<em生体内で></em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する>イメージング技術

NODscidマウスのBMを再構成のオプションのステップは、しかし、TBIの最適化は他の非で再構成を強化する必要があります、NODscid 'ホスト' 100％のマウスに蛍光 'ドナー' BMの80％の取り込みをもたらすべき-immunocompromsed株。マウスが失敗した再構成されている場合、彼らは病気になるし、手順に従って急速に死んでしまう、弱体化したマウスは、追加の食料や水源が必要になる場合があります。 一度終わっICWは、 図2Bivに見られるようになるはずです。これは頭​​蓋骨との結合に強度を与えるようにカバーガラスを取り巻くアクリルの尾根を持つことが理想的です。パーフェクト窓が再現され、彼らの世代（図2C）に続いて、最大8週間のために繰り返しイメージングを可能にします。これらの最適な窓を通して生成された画像は、図3BIに見られるようになります。ウィンドウ生成の不完全性は、貧しい人々の画像を生成します空気はレーザーイメージング（図3Bii）を防ぐように例えば品質は、窓の下に気泡が撮像されているビューの全体のフィールドを防ぐことができ、地域が暗く表示されます。カバースリップ上の過剰接着剤とアクリルで背景の高レベルがあるだろう蛍光および汚れがバックグラウンド蛍光の窓小さなドットに存在する同様にあれば、 図3Biiiで見られるように消されているフィールドの領域は、フィールド（図3Biv）に表示されます。 ICWイメージングの成功は手術手技の完全性によって予め決められている、しかし、さえ最適ICWSは、撮像セッション中に問題が発生することができます。このように、透明度の範囲および程度は、 図3に見られるように生成された画像内に存在する。すべてのものが最適であると、図3Cに描か出版品質の画像が発生します。それはすべてのマウスは不可能であるが、画像の80％​​を期待することは可能であるsがこのように見えるように生成された。現在の顕微鏡のセットアップの主な欠陥の1つは、逆レーザの使用である。マウスは彼らの背中に配置されなければならないと撮影中に呼吸こじつけにつながる可能性が過度のストレスや不快感でこの結果。各画素行を4回結像される四の平均値を最終イメージで表示される、呼吸が、撮像時に発生する平均化と干渉するので、これは "並ぶ"画像を生成する。呼吸こじつけによって引き起こされているような平均化時にどのような動きは、 図3Dに見られるように、画像上の線として現れるアーティファクトが作成されます。撮像中不十分麻酔したマウスにも、この問題が発生することがあります。 '並ぶ'効果がオンに平均化画像を制限することによって低下させることができるが、これはの画像品質を低下させるになり、問題を排除しないことができる。あるいは、マウスが位置を変えたり、呼吸が正規化されたときに再試行することができます。使用Oマウスは "腹臥位 '結像することができるようにウェブ直立2PLMは、この問題を否定するであろう。倒立2PLMでイメージングを持つ追加の問題は、マウス、顕微鏡上にあり、これは、図3Eに見られるような"セグメント化された'イメージにつながる一度ICWを位置決めするための限定されたアクセシビリティを含む。ここで、レーザーとカバーガラスは、互いに垂直に配置し、そのような撮像角度で発生するとされていない。視野の両側が撮像されていない "セグメント化"画像の生成をもたらす。問題は簡単にカバースリップを頭の上に一度完全に水平であることを確認するには、マウスの再配置で解決されて、 図3Aiiで見られるマウント。 ここで紹介するモデルは、具体的に腫瘍組織の血管新生でたBMDCの役割を調べるために使用し、同時に三つの異なるチャネルを使用する能力（チェリー、GFP、遠赤 – Alexa647およびAPC）を示していたのmakinをgのこの特定の物語のためのCFPとSHG冗長。私たちは、窓によって生じる有害な効果を、単一細胞レベルでの血管系へのBM細胞の動員と統合を検討し、最大8週間の縦画像マウスにできました。このモデルは、ソース及び脈管構造の形成と予め終点組織学的分析によって失われた関心のある異なる種類の細胞の相互作用に関する動的情報を収集しやすさを示す。 手順 問題 推論 ソリューション 1.4 粉々に骨ブラントツール鋭利なはさみまたは新鮮な外科用メスの刃を用いて新鮮なマウスを形成骨髄を採取し、骨片は、TV噴射を阻害する 1.5 低抽出（低viscosity）はあまりに遠カット骨終板、貧しい収集方法骨は、近位にできるだけカットし、バックスプラッシュを防ぐために、コレクションチューブの内側骨で収集されるべきである時間は最大限にと注意してBMを抽出するために使われるべき 1ミリリットル中に必要なプールであれば、複数のマウス高い抽出（高粘度） 低収集バッファマウス最大あたり500μlに3レシピエントマウスに分割、余分な0​​.1％BSAでソリューションを希釈 1.6 バート·静脈内注射悪い血管拡張と血管の可視性熱ランプと拡張性を高める。アクセスを支援するために、光源を内蔵した尾静脈拘束に置きマウス 1 病気のマウス感染機関の規則に従ってマウスを生け贄に捧げる。尾は注射前に清掃されていることを確認し、無菌性を確認文化の中で抽出されたBMのマウスは死ぬ悪いBM取り込み死んだマウスの蛍光BM取り込みの％を確認してください。 使用されているマウスの株についてTBI最適 （例では、2つの受信者の1ドナーマウスを使用）BM噴射量を増やす 2.4 マイナー出血硬膜は、掘削中に破らジェルパッドと、連続滅菌生理食塩水洗浄付圧力主要な出血掘削によって損傷脳機関のガイドラインに従ってマウスを生け贄に捧げる 2.8 カバースリップの下に気泡皮質表面との接触不良は、適切な配置を防ぎカバースリップを取り外し、気泡を除去するには、ウィンドウ上にカバースリップをフロートに余分なPBSを追加 2.10 接着時のカバースリップの滑り ACRカルボン質量はカバースリップに圧力を置き、重いと邪魔にカバースリップを外に移動 vetbondとアクリルが適用されているピンセットはカバースリップを押したままにするために使用されるべき 4.2 バート·静脈内注射悪い血管拡張と血管の可視性熱ランプと拡張性を高める。アクセスを支援するために、光源を内蔵した尾静脈拘束に置きマウス 4.4 図3C '裏地'画像こじつけまたは不規則な呼吸フレームからマウスを削除し、回復できるようにする麻酔薬投与のレベルを上げると首を確保するための位置を調整を過度に屈曲または呼吸を防止するために拡張されていない図3C 'セグメント'画像脳は目標と平行ではないそれは平坦であることを確認するためにカバースリップの位置を調整する容器は可視化しない注射は血管見ていない良い血管拡張性を確保するための代替尾静脈、暖かい尾への注射をやり直す高いバックグラウンド汚れたカバースリップ、 気泡、アクリル湿気70％エタノールの布でカバースリップを拭き、アクリル、損傷した脳組織の下に浸透するように浸漬しないでください 表2。トラブルシューティング手順の問題の分野に必要な是正手順のガイドライン。 スキーマ1。実験的なフロー図。これは実験の手順1-4を通じたイベントのタイムラインを示しています。マウスモデルでは、に、一週間以上セットアップされBMが正しく再構成を確認し、腫瘍移植を確実にするために、腫瘍の7日目まで、薬で治療されていません。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図1。 BM再構成。（）BM抽出手順I。後肢の骨の解剖。後肢からII。解剖大腿骨と脛骨、洗浄および抽出のための準備III。骨エンドプレートとを介して除去とフラッシュは、白色の外観を示す空の骨。（B）注射用左右静脈は尾に配置される場合に、どのスキーマが実証された。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= "常に"> 図2。 ICW生成。（A）を推奨無菌セットアップが（B）は、i。露出頭蓋骨の表面は、手術に必要なランドマークを明らかにし、ICWがブレグマとラムダから等距離右半球上に配置されるべきであるII。Periostieumを安全に取り外すことができ、リドカイン溶液を持ち上げIII。ドリルで生成された骨片を除去するために必要な歯科フック。 ニ。歯科アクリルとICWを終えた。（C）三例のウィンドウは、メソッドの再現性を実証する。 <br/> 図3。 2PLM予想される結果。 の全ての画像の緑BM、赤腫瘍、ブルー（擬似色の遠赤色）血管系を示しています （A）私は。小動物照射器内部イソフルランフローを保持ヘッドフレームを示します。 8×11ミリメートルコリメータもにガントリーII。マウスを通して動き回る見ることができるイメージングに必要なヘッドフレームに配置反転、成形plastercineすべてのウィンドウを収容することができることが保証されます。問題の結果の（B）の実証写真私からウィンドウ世代。最適なウィンドウ、II。カバースリップおよびIVにわたってIIIアクリルこぼれ、下に閉じ込められた空気の泡を持つウィンドウ。ウィンドウ自体に汚れが。（C）ICW私の成功した世代に続くイメージングで発生する問題を強調表示します。最適なイメージングIIは。呼吸のアーチファクト'並ぶ'イメージIIIを作成します。カバースリップではなく垂直にレーザに'セグメント化された'イメージを生成します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図4。機能的な目的で使用するとモデルの適応。GFPイメージは白の他の3つのチャンネルをオーバーレイすることができ、真CFP像を明らかにするためにCFP画像から減算される（）CFPポスト撮影処理。 グリーンBM、赤腫瘍、白CSCは、ブルー（疑似着色遠赤）脈管構造 （B）SHGで撮像することができるコラーゲン繊維の実証。 グリーンデキストラン、赤BM、シアンコラーゲン （C）は、i。vitr で VEGFTrapセルVEGFtrap。IIで生産GFPシグナルを示さO。 生体内イメージングが明確VEGFtrap細胞を示し、加えて、あなたが見ているシステムを実証するためにチャンネルを切り替えのしやすさを強調しています。 グリーンVEGFTRap +腫瘍、赤BM、ブルー（色の擬似遠赤色）血管系は （D）赤腫瘍と緑信号オーバーレイの欠如によって示されるように、直接、腫瘍の間質ではなく、細胞内のフルオレセインのコレクションを示します。グリーンフルオレセイン、レッド腫瘍が。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。