一种新型的高分辨率<em>在体内</em>成像技术研究肿瘤生长及治疗颅内结构的动态响应

所有动物的工作已经进行下动物保健使用COMMITEE批准的协议，并遵守所有相关的指南，法规和监管机构执行。 故障排除参考表2。 1。骨髓重建（可选）图1（30分钟准备，5分钟每鼠） 所有手术应该采用严格的无菌技术与蒸压无菌设备。 一个捐助鼠标将重组三大主机小鼠。 的麻醉收件人NODscid的老鼠和位置，与铅屏蔽头，Gammacell 40'赃官照射器的中心内。 照射NODscid的小鼠2.5 Gy的全身照射（TBI）。 关键的一步：由于脑外伤的优化可能需要剂量变化，需要有足够的宿主免疫CELL耗尽不同小鼠品系。 暂停点：主机老鼠可以提前照射，但照射后24小时内应使用。 安乐死的供体小鼠的体制动物保健委员会的指导方针。清洁后肢，并取出胫骨和股骨，都剥离所有多余的组织从的骨头（图1AI 1aii）。 关键步骤：腓骨的骨头是不可行的使用由于非常管腔狭窄。 取出从四个提取的骨骼两端的端板，并使用22 G针和1ml无菌PBS冲洗出来，直到他们是白色的外观（图1aiii）。参考表2。 混合提取的骨髓（BM）暂停以及三个27 G结核菌素针头吸取300微升。提取BM应包含大约2×10 7细胞，并3主机小鼠重组是足够的。参考表2。 成横向三个以前照射NODscid的的老鼠从步骤1.1（图1b）的尾静脉中注射悬浮液。参考表2。 注意：要检查不育的BM注入我们推荐电镀剩余的BM和培养24小时，检查是否感染。在这一点上死亡的首要原因是在新改组的小鼠感染。 2。颅内窗口发生 – 图2（30分钟每鼠） 所有手术应采用严格的无菌技术蒸压消毒设备和热灯保持温暖动物（图2A）。 的麻醉收件人NODscid的小鼠IACUC批准的麻醉剂，：圣阿韦坦IP注射在0.5毫克/克，和位置，与铅屏蔽的头部，在中心内的Gammacell 40'赃官'辐照。去除头发从头皮。此外，申请撕裂的凝胶，以防止角膜脱水。 清洁的头皮先用聚维酮碘溶液中，然后用酒精，然后做一个切口从耳朵的中点正上方的眼睛。取出头皮3毫米一左一右的第一个切口，露出头骨和地标颅骨表面（图2BI）的。 骨膜提升2％利多卡因注射肾上腺素溶液远从颅骨表面（图2Bii）的解剖。 使用2.7毫米的环钻，削弱大脑右半球皮层lambda和前囟门之间2.7毫米的圆的头骨。， 不穿透骨钻（图2Biii）。参考表2。 关键步骤：如果通过头骨钻脑表面会损坏额外TRA的影响结果乌玛。此外，会发生出血过多，防止产生一个清晰的窗口。 取下骨瓣减弱使用解剖镊和牙科钩和故意的，但控制力量（图2Biii）。 （可选）如果想要在肿瘤病理学，选择肿瘤细胞系（荧光报道基因）注入到在步骤2.5中生成的窗口的中心。 细胞悬液和负载针装入10微升30 G汉密尔顿注射器成一个立体的框架。 关键步骤：单元号码需要进行优化，以肿瘤细胞生长所需的使用和时间轴。 U87的文化，我们使用2×10 5个细胞，每只小鼠在10微升。 将鼠标拖到数字立体定向帧生成的窗口的中心点对齐针。 下针，直到它刚好接触到皮质表面和重置数字坐标。 低呃针至3.2毫米到3毫米深皮层组织，并注入。 慢慢缩回针然后取出鼠标从框架。 关键步骤 ：注射液在1分钟的时间和位置注射后留针，以确保减少回流。 关键步骤：如果遇到轻微的出血灌溉用无菌生理盐水为1-5分钟，停止肤浅出血。继续进行后续的步骤。 用无菌PBS下降，以保持脑组织灌溉用水脑表面。 浮法3毫米盖玻片上脑表面大约2.7毫米的窗口产生完全密封。参考表2。 干周围的颅骨到整个暴露的头骨重新密封头皮组织颅骨和盖玻片到位然后应用vetbond的“， 但请不要对多余的，因为它会漏到玻璃板下面，降低成像潜力。 宓所述新鲜牙科丙烯酸粉末和解决方案，约30％（W / V），并申请过顶vetbond。为了确保形成紧密密封到玻璃上，盖玻片边缘（图2Biv）稍微重叠的丙烯酸类参考表2。 注意：牙科 丙烯酸是极其危险的，所以我们建议使用手套和口罩整个程序。 关键步骤：牙科丙烯酸需要在成型过程中的韧性，以确保良好的密封，减少多余。建立压克力窗口将图像模糊。 让老鼠在一个温暖的笼子中恢复。 3。立体定向放射（可选） – 图3（25分钟每鼠） 的变化会存在使用这样的优化将被要求在不同的辐照。我们使用一个自定义设计的辐照。 麻醉小鼠使用异氟醚诱导4％，其次是整个过程中的1.5-2％0.5-1升O 2分钟，到立体定向辐射器内的自定义头阻挡（图3AI）。 取得一个360°的锥束CT扫描的X射线管通过2毫米的铝过滤器运行在40 kVp和0.05毫安的。使用图像引导运动的阶段，指挥的辐射等中心点的右半球，确保它是在背腹方向中央。 将半球准直器，8毫米×11毫米的块。 关键步骤：准直器可设计为许多不同的设置，因此可以提高包括和排除的大脑的不同部位。 8毫米×11毫米定义的半球的大脑区域。 获得单CT正交立体图像，从顶部（AP）和底部（PA）通过准直，以进一步提高的大脑，解剖学和组织的位置可用于omical骨结构的可重复性。 交易所为0.93 mm的铜处理的铝过滤器过滤并管理与X射线管225 kVp和13毫安的在运行在AP的方向从顶部的所需辐射剂量的一半。 回到台架底部位置，再次与X射线管在225 kVp和13毫安的形式在PA的方向的底部运行和管理的第二个一半的辐射剂量。 关键步骤是必不可少的照射，同时在顶部和底部，以减少通过脑组织的RT梯度，它也有助于大脑的中心与对应的等中心点。 （4） 在体内双光子激光显微镜-图3（每节1-3小时） 的变化会存在使用这样的优化将被要求在不同的显微镜。我们采用的是卡尔蔡司LSM510 META激光扫描ConfocAL显微镜。 麻醉IACUC批准的麻醉小鼠，圣阿韦坦IP注射0.5毫克/克和干净的窗口，使用酒精喷雾器。 （可选）注入染料标记血管5-10分钟，成像之前，前尾静脉成像。 Alexa647-葡聚糖0.35微克/克或使用APC-CD31在0.2微克/克。 见表2。 （可选）注入荧光素经尾静脉，剂量为7.7毫克/公斤，5分钟在成像之前，描绘肿瘤。参考表2。 设置频道上的共聚焦显微镜产生的嵌合体小鼠中使用的荧光色素所确定的表1表明本模型中描述的信道。 反转鼠标到可移动显微镜阶段和稳定头部位置可塑橡皮泥。（图3Aii）参考表2。 <P类“jove_content> 关键步骤：ICW需要为垂直于激光点，因此必须水平放置，以确保最佳的摄像。 打开第一通道激光和使用ICW的中心定位。 使用5倍的透镜，并采取进一步更高分辨率的图像作为地图使用整个窗口的图像。 应进行成像使用10X和20X'远距离镜头，以获得最佳的图像质量。 关键步骤：通道和目标在2PLM上的应设置使用前工程细胞在体外成像的小鼠模型，以确保他们强调正确的荧光。 荧光 CFP GFP /荧光素/ FITC mCherry / RFP /红色荧光蛋白 APC /铝exa647 SHG自体荧光 激励激光器 458纳米 488纳米 543纳米 633 nm的变色龙激光820纳米收集过滤器 480-520纳米 500-550纳米 565-615纳米 650-710纳米 390-465纳米 表1中。荧光设置指南用户看到的用于模型中的每一个可用的信道的激光激发和发射光谱的集电极。