Özet

Bir<em> In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için> Model

Published: June 12, 2013
doi:

Özet

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay tarif<em> In vitro</emBu hücreler üretmek için> modeli. Gradyan santrifüj, negatif boncuk izolasyon ve belirli bir hücre kültürü koşulları kullanılarak, monosit türevli histiositlerinden fenotipik ve fonksiyonel çalışmalar için oluşturulabilir.

Abstract

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücre tipi temsil etmektedir. Makrofaj biyoloji okuyan fare modellerinde sıçangil ve insan monosit türevli histiositlerinden arasındaki fenotipik ve fonksiyonel farklılıklar muzdarip. Bu nedenle, burada primer insan makrofaj oluşturmak ve okumak için bir in vitro model tarif eder. Kısaca, bir kol damarından çekilerek periferik kan yoğunluk gradyan santrifüj işleminden sonra, monositler negatif manyetik boncuk ayırma kullanılarak periferik kan mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu monositler sonra makrofaj değişimi ya da polarizasyon farklı indüklemek için özel koşullar altında altı gün boyunca kültüre edilmiştir. Model kullanımı kolaydır ve fare ve insan arasında türe özgü farklılıklardan kaynaklanan sorunlar circumvents. Ayrıca, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin kullanımı daha in vivo koşullarda daha yakındır. Sonuç olarak, burada açıklanan model macrophag incelemek için uygun bire biyoloji, hastalık mekanizmaları ve yeni tedavi hedefleri belirlemek. Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

Introduction

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücresel bileşeni temsil etmektedir ve birçok akut veya kronik enflamatuar süreçleri 1 katkıda bulunur. Makrofajlar, ateroskleroz ya da kanser 2 gibi birçok enflamatuar hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar plastisite yüksek derecede göstermek ve yerel micromilieu 3 bağlı olarak farklı fenotipleri kabul edebiliyoruz. Böylece, makrofaj farklılaşma ve heterojen okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi bilgimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavi hedefleri ve yeni tedavilerin geliştirilmesi tespitine imkan vermek.

Birçok durumda, kemirgen modelleri belirli hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için kullanılır. Ancak, fare modelleri ile makrofaj biyoloji okuyan birçok eksiklikleri eşlik ediyor: (1) perip lökosit alt numaraları oranı (yani monosit ve granülosit)fare veya insanların Heral kan önemli ölçüde fare ve insan patofizyolojisinde monositlerin farklı roller düşündüren değişir. (2) sağlık ve hastalık 4 sırasında fonksiyonu önemli farklılıklar öne fare ve insan periferik kan monositler arasında gen önemli farklılıklar vardır. (3) insan duruma fare modellerinde bulguların transferi oldukça zor hale insan miyeloid hücrelerde yok fare monositler ve makrofajlar (F4/80, LYC, vb.) Tanımlamak için kullanılır işaretleri bir dizi.

Bu nedenle, insan hastalıklarında makrofaj farklılaşması ve heterojen anlaşılması artırmak amacıyla, insan makrofaj çalışma modelleri kullanmak gerekir. Dolayısıyla, burada kullanımı kolay ve farklı makrofaj po ile sonuçlanan, çeşitli koşullar altında in vitro olarak insana ait monositlerden türetilmiş makrofaj çalışma sağlar insan birincil makrofaj nesil bir modeli tanımlamaklarization türleri. Çeşitli çalışmalarda, böylece makrofaj biyoloji ve 5-7 insan ateroskleroz için potansiyel alaka analiz etmek için monosit türevli primer insan makrofajlarda in vitro modeli kullandık.

Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

Protocol

1. Protokol Aşağıdaki gibi tamponlar hazırlamak: Hücre izolasyonu için tampon hazırlayın: "tampon yıkayın" PBS içinde =% 0.02 EDTA (kullanımı 0.5 M EDTA). Monosit izolasyonu için tamponu hazırlayın: "durulama MACS tamponu" =% 0.5 BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 mL) eklenmiştir. Degas tampon. "FACS tampon" PBS =% 10 FCS ve "sabitleme tampon" PBS =% 1 PFA: hücrelerin FACS boyaması ve depolama tamponu hazırlayın…

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, rutin 25.1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml kan (26 bağımsız deneylerden ortalama ± standart hata, Şekil 1A) edinin. CD14 için akış sitometrisi ile boyama ile saptandığı gibi monosit saflık rutin olarak% 95'ten daha fazla (97.1 ± 0.4%, 3 bağımsız deney, Şekil 1B ortalama ± standart hata) 'dir. Tripan mavi boyama ile saptandığı haliyle taze izole edilmiş monositlerin, hücre canlılığ?…

Discussion

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel hücre tipini temsil etmektedir. Ateroskleroz veya kanser 2 de dahil olmak üzere, pek çok enflamasyonlu hastalıkların önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, makrofaj biyoloji okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi üzerinde bilgilerimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavilerin geliştirilmesi izin vermek.

Birçok çalışma, fare modelleri eksprese uygulamak veya ilgi bazı ge…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz mükemmel teknik yardım için Nadine Wambsganss teşekkür ederim. Bu çalışma CAG İnovasyon Fonu FRONTIER (Heidelberg Üniversitesi) bir hibe ile Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) bir hibe ile ve kısmen desteklenmiştir

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Yorumlar
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398  
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250  
EDTA Sigma T9285  
BSA Sigma A-8806  
FCS Invitrogen    
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059  
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000  
FACS tubes Fisher 352008  
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074  
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458  
Nutridoma-SP Roche 11011375001  
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25  
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80  

Referanslar

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

View Video