Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunelektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um biologische Moleküle auf subzellulärer Ebene zu studieren. Antikörper gekoppelt elektronendichten Marker wie kolloidales Gold offenbaren kann die Lokalisation und Verteilung von spezifischen Antigenen in verschiedenen Geweben ^ein. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken sind pre-embedding und Post-embedding Techniken. In vor-Einbettung Immunogold-Elektronenmikroskopie (EM)-Techniken, muss das Gewebe permeabilisiert zu Antikörper Eindringen zu ermöglichen, bevor er eingebettet werden. Diese Techniken sind ideal zum Konservieren Strukturen aber schlechte Penetration des Antikörpers (oft nur die ersten paar Mikrometer) ist ein erheblicher Nachteil, ^2. Die post-Einbettung Kennzeichnung Methoden können dieses Problem vermeiden, weil Kennzeichnung erfolgt auf Abschnitten von festen Geweben, in denen Antigene leichter zugänglich sind. Im Laufe der Jahre wurden eine Reihe von Änderungen, die post-Einbettung verbessert Immunreaktivität zu verbessern und Ultrastruktur bewahren <sup> 3-5.

Gewebefixierung ist ein entscheidender Teil des EM-Studien. Fixative chemisch vernetzen die Makromoleküle, die Gewebestrukturen einrastet. Die Wahl der Fixateur wirkt nicht nur strukturelle Erhaltung, sondern auch Antigenität und Kontrast. Osmiumtetroxid (OsO _4), Formaldehyd, Glutaraldehyd und wurden die Standard-Fixiermittel für Jahrzehnte, einschließlich des zentralen Nervensystems (CNS) Gewebe, die besonders anfällig für strukturelle Beschädigungen bei chemischen und physikalischen Verarbeitung sind. Leider ist OsO ₄ hochreaktiv und wurde gezeigt, dass maskieren Antigene ^6, was zu einer schlechten und unzureichende Etikettierung. Alternative Ansätze zur chemischen Fixierung vermeiden sind Einfrieren der Gewebe. Aber diese Techniken sind schwierig durchzuführen und erfordern teure Instrumente. Um einige dieser Probleme anzugehen und ZNS-Gewebe Kennzeichnung, Phend et al verbessern. ersetzt OsO ₄ mit Uranylacetat (UA) und Tannin acid (TA), und erfolgreich zusätzliche Modifikationen eingeführt, um die Empfindlichkeit der Antigennachweis und strukturelle Erhaltung im Gehirn und Rückenmark Geweben ^{7 zu} verbessern. Wir haben dieses Osmium-free post-Einbettung Methode Rattenhirngewebe angenommen und optimiert die Immunogoldmarkierung Technik zu erkennen und zu studieren synaptischen Proteinen.

Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die ultrastrukturellen Lokalisation der synaptischen Proteinen in Ratten hippocampalen CA1 Pyramidenzellen bestimmen. Wir verwenden organotypischen hippocampalen kultivierten Scheiben schneiden. Diese Scheiben halten die trisynaptic Schaltung des Hippocampus, und sind daher besonders nützlich zur Untersuchung synaptischer Plastizität, ein Mechanismus weithin angenommen, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen. Organotypischen hippocampalen Schnitten aus postnatalen Tag 5 und 6 Maus / Rattenjungen können wie zuvor beschrieben ⁸ werden und sind besonders nützlich, um akut Knockdown oder überexprimieren exogenen Proteinen. Wir haben dieses Protokoll ch verwendetaracterize Neurogranin (Ng), einem Neuronen-spezifischen Proteins mit einem kritische Rolle bei der Regulierung der synaptischen Funktion ^8,9. Darüber hinaus haben wir es verwendet, um die Lokalisierung von ultrastrukturelle Calmodulin (CaM) und Ca ^{2 +} / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) ¹⁰ charakterisieren. Wie in den Ergebnissen dargestellt, ermöglicht dieses Protokoll gute ultrastrukturelle Erhaltung der dendritischen Dornen und effiziente Kennzeichnung von Ng zu helfen charakterisieren ihre Verteilung in der Wirbelsäule ^8. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren eine breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung viele andere Proteine ​​in neuronalen Funktionen beteiligt sind.