Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Microscopia Immunoelectron è un potente strumento per studiare molecole biologiche a livello subcellulare. Anticorpi accoppiati elettroni dense marcatori come oro colloidale può rivelare la localizzazione e la distribuzione di antigeni specifici in vari tessuti ^1. Le due tecniche più utilizzate sono pre-embedding e post-embedding tecniche. In pre-embedding immuno-microscopia elettronica (EM) tecniche, il tessuto deve essere permeabilizzate per consentire la penetrazione di anticorpi prima di essere incorporato. Queste tecniche sono l'ideale per conservare le strutture, ma scarsa penetrazione dell'anticorpo (spesso solo i primi micrometri) è uno svantaggio notevole ^2. I post-embedding metodi di etichettatura possibile evitare questo problema perché l'etichettatura avviene su sezioni di tessuti fissati in cui gli antigeni sono più facilmente accessibili. Nel corso degli anni, una serie di modifiche hanno migliorato le post-embedding metodi per migliorare e preservare immunoreattività ultrastruttura <sup> 3-5.

Fissazione dei tessuti è una parte cruciale di studi EM. Fissativi chimicamente reticolare le macromolecole per bloccare le strutture di tessuto in posizione. La scelta di fissativo influenza non solo la conservazione strutturale ma anche antigenicità e contrasto. Tetrossido di osmio (OsO _4), formaldeide e glutaraldeide sono stati i fissativi standard per decenni, anche per il sistema nervoso centrale (SNC), tessuti che sono particolarmente inclini a danni strutturali durante la lavorazione chimica e fisica. Purtroppo, OsO ₄ è altamente reattivo e ha dimostrato di mascherare antigeni ^6, con conseguente etichettatura povero e insufficiente. Approcci alternativi per evitare la fissazione chimica comprendono il congelamento dei tessuti. Ma queste tecniche sono difficili da eseguire e richiedono strumentazione costosa. Per risolvere alcuni di questi problemi e di migliorare tessuto del SNC etichettatura, Phend et al. sostituito OsO ₄ con acetato di uranile (UA) e tannico acid (TA), e introdotto con successo ulteriori modifiche per migliorare la sensibilità della rilevazione dell'antigene e conservazione strutturale nel cervello e del midollo spinale ^7. Abbiamo adottato questo osmio senza post-embedding metodo al tessuto del cervello di ratto e ottimizzato la tecnica immunogold etichettatura per rilevare e studiare le proteine ​​sinaptiche.

Vi presentiamo qui un metodo per determinare la localizzazione ultrastrutturale delle proteine ​​sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali. Usiamo organotipiche fettine di ippocampo in coltura. Queste fette mantenere la circuiteria trisynaptic dell'ippocampo, e quindi sono particolarmente utili per studiare la plasticità sinaptica, un meccanismo ampiamente pensato alla base dell'apprendimento e della memoria. Organotipiche fettine ippocampali di postnatali giorni 5 e 6 di topo / ratto cuccioli possono essere preparati come descritto in precedenza ^8, e sono particolarmente utili per acutamente knockdown o esprimono molti proteine ​​esogene. Abbiamo già usato questo protocollo per characterize neurogranin (Ng), un neurone-specifica proteina con un ruolo critico nella regolazione della funzione sinaptica ^8,9. Abbiamo anche usato per caratterizzare la localizzazione ultrastrutturale di calmodulina (CaM) e Ca ^{2 +} / CaM-dipendente proteina chinasi II (CaMKII) ^10. Come illustrato nei risultati, questo protocollo permette una buona conservazione ultrastrutturale delle spine dendritiche e l'etichettatura efficiente del Ng per caratterizzare la sua distribuzione nella colonna vertebrale ^8. Inoltre, la procedura qui descritta può avere un'ampia applicabilità in studio molte altre proteine ​​coinvolte in funzioni neuronali.