Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Die ministat array oben beschrieben und in (Abbildung 1A, B) wurde verwendet, um Kultur eine haploide MATa Laborstamm der Bäckerhefe (S288C) unter Sulfat-einschränkenden Bedingungen wie zuvor beschrieben. 10 Wir testeten die Wirksamkeit für gemeinsame Chemostat Anwendungen einschließlich der Bestimmung der Physiologie und experimentellen Entwicklung. Um die Ministate validieren, wiederholten wir mehreren Experimenten zuvor in industriellen Fermentern durchgeführt für Chemostat Einsatz modifiziert. 10,20,21 ATR Sixfors Fermentern bei einem 300 ml Arbeitsvolumen ausgeführt wurden, mehr als das Zehnfache des Volumens der Ministate und weisen erheblich unterschiedlichen Modi Kultur Belüftung und Rühren. Wir haben versucht, Geräte Stabilität, steady state Physiologie, experimenteller Evolution Ergebnisse und Genexpressionsmuster mit diesen Fermentern erhalten replizieren. Da Einheitlichkeit der Verdünnung und Belüftung wichtige Aspekte der Chemostat Design sind wir megesicherter die tatsächliche Verdünnungsrate in 32 Ministate nach 15 Generationen Wachstum und gefunden, dass mit einem Soll Verdünnungsrate von 0,17 Vol / hr (4-5 Tropfen / min) wir eine durchschnittliche Verdünnungsrate von 0,17208 erreicht mit einer Standardabweichung von 0,0075 in 32 repliziert. Dieser Bereich war in unserem typischen Toleranz von + / -0,01 vol / h Unterschied zur Zielsetzung, hinter dem großen Veränderungen in der Genexpression beobachtet worden. 22-23 Across 4 Ministate die Strömungsgeschwindigkeit der Luft ermittelt wurde, um 307,5 ​​ml sein / min mit einer Standardabweichung von 9,57 ml / min. Dies legt nahe, dass Luftstrom in den Kammern ist robust und gleichmäßig zwischen den vier Kammern unterteilt ist und einen Wert ähnlich dem für die Belüftung in der industriellen Fermentern beschrieben. 20 Wir zuvor beobachteten wiederkehrenden Amplifikation des hochaffinen Schwefel-Ionen-Transporter SUL1 in 8/8 Sulfat-begrenzten Evolutionsexperimenten in Hefe. 10 Angesichts der Konsistenz der Ergebnisse unter this Zustand, den wir wählten Sulfat-Beschränkung auf unser System die Fähigkeit zu testen. Eine erforderliche Element Chemostatkultur ist die Notwendigkeit, eine konstante chemische Umgebung aufrechtzuerhalten. Schwankungen in der Abundanz eines limitierenden Nährstoff oder andere Veränderungen in der Umgebung der Regel in einer Änderung der Anzahl von Zellen in einer Kultur führen. Wir maßen optische Dichte als Proxy für die Zellzahl (2A) und der gemessenen Reproduzierbarkeit in 16 replizieren Kulturen, mit der eine durchschnittliche A600 von 1,12 (~ 10 9 Zellen) nach ~ 15 Generationen Wachstum mit einer Standardabweichung von 0,057 Einheiten oder 5,1 %. Zum Vergleich, zeigten Messungen von 4 replicate Kulturen in der industriellen Fermentern gezüchtet genommen eine Standardabweichung von 2,5%. Zellen wurden gut gemischt in der Wachstumskammer: Messungen der OD und Zellzahl vom Ausfluss Spur getroffen waren äquivalent zu Proben direkt aus der Kultur Röhre (Daten nicht gezeigt) entnommen. Diese Ergebnisse zeigen die Robustheit der Plattform eined Fähigkeit, eine konstante chemische Umgebung in einem ähnlichen Toleranz als die industrielle Fermenter zu erhalten. Als sensibler Auslesen der Physiologie, verglichen wir genomweite steady state Genexpression von Kulturen unter Sulfat-Limitierung in den Ministate und im industriellen Fermenter gezüchtet. Genexpression in den Ministate zeigte einen hohen Grad der Ähnlichkeit auf drei biologische repliziert (2B). Wir bereits erwähnt, dass für die RNA von zwei replizieren Sixfors Chemostate abgeleitet und an einen Mikroarray mit-hybridisiert, fiel Expression von 99% der Gene innerhalb einer 1,5-fachen Bereich, was die Verwendung von 1,5 X als empirische Bedeutung Cutoff. 21 Genexpression aus drei replicate Ministate Vergleich paarweise, zeigten 99% der Gene fiel innerhalb einer 1,5-1,7 fachen Bereich, vergleichbar mit den Ergebnissen aus den industriellen Fermentern. Die drei Proben einzelne Arrays und der paarweisen Verhältnisse berechnet danach wurden hybridisiert, so dass diese values beinhalten inter-Array Noise neben biologischen Rauschen, potentiell Überschätzung der Variation zwischen Wiederholungen gemäß den veröffentlichten, Co-hybridisierten Ergebnissen verglichen. 138 Gene wurden unterschiedlich exprimierten> 1,5-fach in allen drei ministat als Wiederholungen zu einer Probe von einem passenden Kultur im industriellen Fermenter gezüchtet gesammelt verglichen. Gene in der Expression in den Ministate zurückgegangen waren stark für den Eisenstoffwechsel bereichert. Diese Signatur kann sowohl den unterschiedlichen Metallzusammensetzung jedes Gerätekonfiguration: die Sixfors Vorrichtung einen Metall Laufrad und Belüftung Anordnung im Kulturmedium eingetaucht ist, und das Medien Ballonflaschen bisher verwendeten Metall auch Hardware erforderlich. Die ministat nutzt Edelstahlnadeln, aber keine anderen metallischen Komponenten. Gene mit erhöhter Expression wurden weitgehend mit Zellmembranen assoziiert, obwohl die biologische Bedeutung dieser Vereinigung ist unklar. Schließlich testeten wir experimenteller Evolution under diese Bedingungen. Nach 250 Generationen von Sulfat-begrenztes Wachstum, zeigten 4/4 Klone aus 4 unabhängigen entwickelnden Populationen getestet Verstärkung SUL1 von Array Comparative Genomic Hybridization (CGH, 2C) nachgewiesen. Dieses Ergebnis ist konsistent mit den Ergebnissen in größerem Volumen Chemostate gegenüber ähnlichen Zeitabständen. 10 Abbildung 1. A. Design und Anordnung der ministat Array. B. Design der Kultur Kammer. Abbildung 2. A. ExperimeDaten, die zeigen, dass NTAL Kulturen Gleichgewicht erreichen innerhalb von zehn Generationen Wachstum (n = 16). B. Expression Daten für drei biologische repliziert S1-3 während des stationären abgetasteten unter Sulfat Einschränkung gegenüber einer gemeinsamen Referenz in einer angepaßten begrenzten Sulfat-Sixfors Chemostat gezüchtet . C. SUL1 Amplifikationen in Ministate nach 250 Generationen von Wachstum in einem Sulfat-begrenzten Umwelt gewonnen. Genomische DNA von jedem Klon wurde entwickelt, um Vorfahren DNA durch CGH verglichen wie beschrieben. 21 Mittlere Kopienzahl für jede amplifizierte Region wurde berechnet und ist neben jeder Amplikon gezeigt. Alle Microarray-Daten werden in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE36691 hinterlegt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.