近红外光学投影层析成像技术在糖尿病研究β细胞质量分布的评估

1。样品制备和扫描 1.1样品制备基本上如前所述7执行下面的过程。 收获的胰腺。用冰冷的PBS，以避免蛋白降解。 在PBS中的4％PFA中修复的组织为2-3小时，在冰上。确保叶是“传播”期间固定。这将有利于确定后重建的解剖标志。 过量的PBS洗涤30分钟。 脱水胰腺逐步在甲醇（33，66％，100％），15分钟/步。这最大限度地减少漂白过程（见步骤5），并防止气泡的形成，细胞的破坏，在冷冻 – 解冻（见第7步）。 孵育组织中新鲜制备的甲醇：H 2 O 2：DMSO一个= 2:1:3的比例在室温放置24小时，以便淬灭内源性组织荧光漂白缓冲器中。对于较大的样本，交流新bleachi纳克和另一个24小时的孵育缓冲。 在过量的甲醇进行清洗，ON。 冻结 – 解冻至少5个循环，在-80℃下 – RT以促进抗体渗透率。 再水合逐步回TBST中（​​33，66％，100％），15分钟/步。 座在TBST中含10％血清（优选来自同一物种的二次抗体生成），5％DMSO和0.01％NaAz为12-24小时在RT 与初级抗体孵育48小时的封闭缓冲液，在RT，延长至72小时，较大的样品（这里所用的抗体的试剂的表中列出）。 超过TBST清洗，ON。 与荧光共轭的次级抗体孵育48小时，在RT，延长至72小时，较大的样本。 超过TBST清洗，ON。 1.2 下面的过程介绍了如何安装在琼脂糖样品，将其附加到自定义的样品架（ 见图7）之前选择扫描。 分离脾，十二指肠和胃瓣图3A在Hörnblad 等[3]。波瓣之间的关系被进一步澄清在Hörnblad 等 11。 准备1.5％（W / V）低熔点琼脂糖DH 2 O，过滤器，冷却至37°C和组织在卫生署2 O冲洗，以洗去清洁剂和消除气泡前琼脂糖上镶嵌冰。 剪出的琼脂糖块包围您的样品，并留下一个〜1厘米的样品之间的间隔物和碱的琼脂糖。修剪琼脂糖块的尖锐的边缘（≤90°），以减少光散射。 在MeOH（33，66％，100％）逐步脱水样本，允许每个步骤之间的时间以平衡。当试样下沉，它被认为是平衡。 清除样品中苯甲醇1:2的解决方案：苄基奔驰烷基酯（巴布），直到它变得透明。交易所的巴布的解决方案和孵育12小时。 定位清零的样品的样品架中，并通过插入2针通过琼脂糖的间隔件的保持架的凸缘通过钻孔，将它固定。 将样品放置在扫描仪和淹没填充用巴布结算溶液到一个反应杯中。当比较胰腺的一系列相同的放大倍数应被用于所有扫描。应该优化的倍率系列中的最大的样本。 1.3试样的定位在AR 以下协议描述一个示例使用的COM-AR算法的程序来精确定位。此程序仅适用时的投资回报率，包括整个标本。的算法的详细说明，请参阅Cheddad 等[2]。 获取图像的样本在两个位置的BOTh的解剖和信号通道。位置1，在0℃（用X-轴）相关联，显示最大的投影区域，在90℃（与Z-轴）和位置2。我们正在使用的的GFP通道可视化的解剖。 应用期望最大化（EM）算法的解剖图像上的阈值的ROI。 计算的COM点（x坐标），在步骤2中获得的在0°和90°突起的二进制图像。 叠加的垂直线，通过在0°和90°的信号信道的图像的步骤3中所识别的COM计算点。 使用在步骤4中获得的图像，作为参考样品，使视场的中心线穿过样品找到的COM点移动。 1.4扫描调整曝光时间，以实现最高的信号噪声比成为可能，而不饱和婷的投影图像的任何区域。要扫描所有通道，重复上述步骤。 选择要扫描的第一荧光通道的过滤器组。从更短的λ荧光基团的发射较长的λ激发荧光基团，从而导致光漂白。为了尽量减少这种可能性，扫描荧光激发λ最长的第一次。 打开快门，以照亮样品和收集超过360°的荧光信号，为每个通道沿垂直轴转动样品。用于NIR-OPT设置的步距角为0.9°的Bioptonics 3001扫描仪0.45°。 下一个通道，并选择适当的过滤器，请按以上。 2。计算处理和重建 2.1收购后错位检测和纠正（A值调整） 在投影层析成像，它是在普通必要分配后的取向值微调的图像重建的前沿旋转轴线的位置的突起。然而，在相机的角度朝向光轴像差小可以导致非均匀的A值，沿样品的长度，从而诱导几何失真。为了避免这种扭曲，在整个样本的准确和统一后的调整值（A值）的计算方法可应用于2。 使用离散傅里叶变换的划分​​的投影的特定信号，在0°和180°成8像素高度块，并计算每个块之间沿x-轴的移位（A值）。 应用最小二乘法的线性回归分析，以帮助计算的角度θ'，它描述的x轴沿试样长度的移位的斜率，并找到一个旋转中心点。 在扫描过程中，旋转所有幻灯纠正偏差ctionsθ'/ 2左右的旋转中心点。 2.2对比度受限自适应直方图均衡（CLAHE） 为了便于检测和分割对象（胰岛）表现出非常弱的信号，该信号是在风险的“阈值”在重建过程中和/或分割的定量评估，CLAHE算法可以被应用于投影图像。 CLAHE操作有两个主要的强度转换： 估计的局部对比度的投影图像中的非重叠的块内均衡。 标准化的强度，然后通过双线性内插块之间的边境地区。 对比度限制的名称是指到夹子的限制，它被设置为避免在图像中的饱和像素。在这个协议中，MATLAB内置函数“adapthisteq”使用默认的C应用唇下限0.01和大小为256瓦。请注意，最优瓷砖大小需要凭经验进行测试，并且可以取决于分析的检体上。在Hörnblad 等[3]上的算法和实施例中可以找到更多细节。 注意上面列出的计算处理步骤（包括COM-AR，A值调整和CLAHE，见1.3-2.2）是建立在标准算法，并在MATLAB（MathWorks公司）执行。 2.3断层重建和异面绘制使用滤波反投影算法，现在可以被重建的校正和归一化的图像，用统一的不对中补偿和优化的动态范围的最低限度的要求。在该协议中，所有的重建进行滤波反投影法在NRecon软件（SKYSCAN），版本1.6.8（=“_blank”> http://www.skyscan.be/products/downloads.htm）。请注意，成像的对象的放大率取决于平行束几何结构中，除非它的镜头的焦点距离的摄像设置中实现。因此，导入的投影数据集的NRecon软件时，它是重要的，包括在随附的源间的距离（mm）和扫描仪的旋转方向（逆时针输入“cc”和顺时针输入“顺时针”）的正确的对象日志文件，以避免在重建过程中的锥束引起的工件。 可视化和量化的堆栈获得的虚拟部分，产生三维等值面采用合适的图像处理软件，如Imaris或Volocity。 小鼠胰岛分离和移植程序进行糖尿病研究所的临床前细胞处理和转化模式的核心，根据协议，评论和批准MIAM大学我实验动物护理和使用委员会。动物研究的伦理委员会批准，瑞典北部，所有其他实验动物。