El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca^{2 +} Transitorios y corrientes de membrana

Los protocolos experimentales deben ser aprobados por el comité de ética local y todos los pacientes deben dar su consentimiento informado por escrito. Nuestra investigación fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg (# 2011-216N-MA) y se llevó a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. 0. Obtención de tejido auricular humano Durante los procedimientos de canulación de rutina en pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto para injerto de bypass cardiopulmonar, la punta del apéndice auricular derecho generalmente se extirpa y se puede utilizar para el aislamiento de miocitos auriculares. Después de la escisión de la muestra de tejido se transfiere inmediatamente a un tubo de 50 ml Falcon estéril con Ca 2 + sin solución de transporte que contiene 2,3-butanodiona monoxima (Tabla I; BDM, inhibidor de la contracción, la prevención de los miocitos contracture). Con tiempos de transporte entre los 30 y 45 min, no reconocimos una clara ventaja de refrigeración u oxigenación con respecto al número y calidad de los miocitos auriculares aislados. En general de transporte al laboratorio debe ser lo más rápido posible. Sin embargo, si es más largo el tiempo de transporte no se puede evitar, de transporte a 4 ° C en solución oxigenada podría ser ventajoso. 1. Prearrangements Encender el thermocirculator, que controla la temperatura del vaso de precipitados con camisa (Tabla II). Asegúrese de que la temperatura dentro del recipiente es igual a 37 ° C. Cubrir el vaso con una tapa de vidrio para mantener una temperatura constante dentro del vaso de precipitados a lo largo de todo el proceso de aislamiento. Pese la colagenasa I y XXIV proteasa en tres vasos de vidrio y guárdelo a temperatura ambiente. Las enzimas se diluyeron justo antes de su uso. Tienda 20 ml de Ca 2 + solución libre en una placa de Petri a 4 ° C. Tienda 250 ml de Ca 2 + solución libre en un baño de agua a 37 ° C. 2. Limpieza del tejido Transferir la muestra de tejido, junto con la solución de transporte en una placa de Petri (~ 10 cm de diámetro) y eliminar el tejido graso utilizando más o menos unas tijeras. Pesar la muestra de tejido. Entre 200 y 600 mg se utilizan para el aislamiento de células. El tejido restante se puede congelar en nitrógeno líquido para su posterior análisis bioquímico. Transferir la muestra de tejido en la placa de Petri que contiene 20 ml de solución de Ca 2 + libre a 4 º C (véase el paso 1.3) y cortar la muestra de tejido en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm de tamaño 3. Los siguientes pasos deben ser ejecutados a 37 ° C y bajo gasificación continua con O2 al 100%. Una punta de la pipeta se puede colocar sobre el tubo de oxígeno para evitar la fuerte burbujeo y generar un flujo de aire continuo. La transferencia de los trozos de tejido junto con la solución 2 + libre de Ca enal vaso de precipitados con camisa y se agita cuidadosamente durante aproximadamente 3 minutos con una barra de agitación magnética. Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido para establecerse durante unos segundos. Colar con cuidado el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso con unas pinzas. Vuelva a llenar el vaso con Ca 2 + solución gratuita y repetir la etapa de lavado 2,4 y 2,5 dos veces. 3. En primer lugar la digestión enzimática Vuelva a suspender los trozos de tejido con 20 ml de solución de enzima E1 (Tabla I) que contiene colagenasa y proteasa y se agita cuidadosamente durante 10 min. Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +. Después de 35 min la cepa cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II) de una manera que la mayor parte de los trozos de tejido permanecen en el vaso de precipitados. Volver restollovió trozos de tejido de la malla en el vaso de precipitados. 4. En segundo lugar digestión enzimática Resuspender los trozos de tejido de nuevo con 20 ml de solución de enzima E2 que contiene colagenasa I sólo (Tabla I). Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución inmediatamente para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +. Durante el segundo tijeras para cortar el uso de digestión más coágulos tejido ocasionalmente. Después de 5 minutos tomar una muestra con una pipeta Pasteur para comprobar la disociación de las células. Repita esto cada 2-3 minutos hasta que aparezcan en forma de barra, cardiomiocitos estriados. Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido que se establecen por unos 20 a 30 segundos. Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo A). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso. Vuelva a suspender los trozos de tejido en el vaso con 20 ml Storasolución de GE (Tabla I) 10 y disociar aún más las células por trituración mecánica suave con una pipeta serológica de 20 ml con dispensador. Trate de evitar la formación de burbujas ya que las burbujas son perjudiciales para la supervivencia celular y la calidad. Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo B). 5. Preparación final y ajuste final de Ca 2 + de concentración Centrifugar tanto en tubos Falcon de A y B (véase el paso 4.5 y 4.7) a 95 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante de ambos tubos cuidadosamente por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. Descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender las dos pastillas de 1,5 ml solución de almacenamiento (Tabla I) cada uno (temperatura ambiente). Agregue dos veces 7,5 l de solución de 10 mM CaCl 2 a cada Falcon y remover con cuidado. Incubar durante 10 min después de cada paso. Añadir 15 l de solución 10 mM de CaCl2 para obtener una final concentración de Ca2 + de 0,2 mM. 6. Carga de los miocitos con el Ca 2 +-fluorescente indicador Fluo-3 AM (Figura 1) Transferir 1,5 ml de suspensión celular (tubo A y / o el tubo B) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (tubo Eppendorf). Los siguientes pasos deben ser ejecutados bajo la consideración de la sensibilidad a la luz del fluorescente de Ca 2 + Indicador Fluo-3. Disolver 50 g de la membrana permeable derivado de éster de acetoximetilo de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabla III) en 44 l de Pluronic F-127 (Tabla III) solución madre (20% w / v en DMSO anhidro) para conseguir un 1 mM de Fluo-3 a.m. solución madre, que puede ser almacenado a -20 ° C durante un máximo de 1 semana. Añadir 15 l de la Fluo-3 a.m. solución madre al tubo de microcentrífuga que contiene 1,5 ml de suspensión de células (véase el paso 6.1) y agitarcuidadosamente. Incubar la suspensión de células durante 10 min en una caja ópticamente opaca. Centrifugar brevemente a aproximadamente 6.000 rpm. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de solución de baño (Tabla IV). Agregar la suspensión de células durante aproximadamente 30 min para la de-esterificación antes de comenzar con los experimentos. 7. Patch-clamp y epifluorescencia Ca 2 + mediciones simultáneas Dado que las mediciones de patch-clamp no son el tema principal de esta revisión, remitimos al lector interesado a otras publicaciones que proporcionan una descripción más profunda de esta técnica. 11-14 En aras de la exhaustividad, se proporciona un breve resumen de un protocolo para medir potenciales de acción o L-tipo Ca 2 + corrientes, ambos junto con grabaciones simultáneas Ca 2 +-transitorios. Durante los experimentos miocitos se superfundieron a 37 ° C con bañera solutien (Tabla IV) usando un sistema de perfusión rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para los experimentos de fijación de voltaje, corrientes de K + se bloquean mediante la adición de 4-aminopiridina (5 mmol / L) y BaCl 2 (0,1 mmol / L) a la solución del baño. Microelectrodos de vidrio de borosilicato se utilizan y deben inclinar han resistencias de 2-5 mW cuando se llena con la solución de la pipeta (Tabla V). Además de la Fluo-3 a.m. carga de los miocitos (vea el paso 6), Fluo-3 también se incluye en la solución de la pipeta (Tabla V). Fluorescencia se excita a 488 nm y la luz emitida (<520 nm) convierte en [Ca 2 +] i suponiendo donde k d = constante de disociación de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescencia;. F max = Ca 2 +-saturada de fluorescencia obtenido al final de cada experimento 12 Ambas señales eléctricas y señales de Ca 2 + epifluorescencia se registran simultáneamente. Los potenciales de acción son estimulados a 0,5 Hz en modo de corriente-clamp con 1 ms pulsos de corriente de fuerza umbral de 1,2 x. De tipo L Ca 2 +-corrientes se miden en el modo de fijación de voltaje con un potencial de mantenimiento de -80 mV y una rampa de 100 mseg-pulso a -40 mV para inactivar el ayuno de Na +-corriente, seguido de un 100-mseg prueba de pulso a 10 mV a 0,5 Hz.